易基因-原核转录组“rRNA捕获探针及其应用“方法获发明专利授权

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核糖体RNA(rRNA)是细胞内含量最高的一类RNA，占胞内所有RNA总量的80％以上。其与蛋白质结合形成核糖体，在mRNA的序列引导下转运特定的氨基酸合成蛋白质肽链。由于核糖体RNA的占比含量极高，在总RNA测序研究其它功能性RNA的表达丰度、修饰状态等，核糖体RNA将侵占大量的可用数据，如何在检测前针对不同物种有效的去除核糖体RNA，或精准分离目标类型RNA进行相应检测，已成为“转录组学”研究和“表观转录组学”研究样本前期制备的核心技术问题。

相关技术存在以下问题：在真核生物中通常会利用oligo dT磁珠钓取含有poly A尾巴的总mRNA，然后通过文库构建进行高通量测序分析细胞或组织mRNA的表达情况。但原核生物的mRNA含量极低，约占总RNA的2％-5％左右。而且，绝大多数原核生物mRNA都不存在3’端的poly(A)结构。因此，对原核生物的mRNA分离并进行检测非常困难。

针对上述技术问题，本发明提供了一种rRNA捕获探针及其应用方法，以解决现有rRNA去除方法中存在的一种或者多种的问题。

2023年9月15日，深圳市易基因科技有限公司开发的《rRNA捕获探针及其应用》获得专利授权，突破了相关技术的瓶颈。rRNA捕获探针技术由易基因科技自主研发研发，于2019年申请发明专利，并于今日获得发明专利授权。

本发明通过分析蓝细菌转录产物及rRNA序列特征，设计核糖体去除探针，搭建了RNA-DNA杂交消除体系和RNA建库流程，可有效去除转录产物中90％以上的核糖体RNA序列。

这样的rRNA捕获探针对于转录组测序分析，可以有效克服原核生物mRNA不含polyA尾巴，无法通过oligo dT富集分离的技术难题，极大的节省了测序数据量和成本。

此外，由于探针仅捕获rRNA序列，通过高通量测序，相比较与真核mRNA钓取，可除了检测到mRNA的表达，修饰外，还可以检测到非编码RNA，lncRNA、tRNA、circle-RNA和小RNA等。

而在RNA修饰检测应用上，本技术的方法流程，不仅可以设计合成探针序列，在微量总RNA(约2ug)中检测哺乳动物rRNA外的其它RNA修饰情况，还可以进一步的用于分析植物、微生物等其它物种的修饰水平并实现另一种RNA修饰检测技术并试剂盒化。

技术案例：

易基因针对检测原核菌个性化设计rRNA去除探针的原核转录组研究成果见刊《CHEMOSPHERE》

标题：Longitudinal Physiological and Transcriptomic Analyses Reveal the Short Term and Long Term Response of Synechocystis Sp. Pcc6803 to Cadmium Stress（纵向生理学和转录组学分析揭示了集胞藻PCC6803对镉胁迫的短期和长期响应）

时间：2022-05-02

期刊：CHEMOSPHERE

影响因子：IF 8.8

技术平台：原核转录组测序分析、WGCNA分析

摘要：

由于镉(Cd)的生物蓄积性和生物不可降解性，即使在低浓度下，镉也会对生态系统构成严重威胁。微藻是一种很有前途的重金属去除剂和有效的工业污水净化剂。然而，关于镉胁迫下微藻的短期和长期响应分子机制的详细报道很少。本研究对微藻在EC50值（concentration for 50% of maximal effect,EC50）下的吸附行为（生长曲线、Cd去除率、SEM、FTIR和胞外多糖(EPS)动态变化）、细胞毒性（光合色素、MDA、GSH、H2O2、O2-）和胁迫响应机制进行探讨。通过原核生物的转录组RNA-seq在对照和15 min、48 h、72 h和96 h处理组中检测到1413个差异表达基因（DEGs）。这些基因被证明是镉敏感DEGs，且与核糖体、氮代谢、硫转运蛋白和光合作用相关。WGCNA（加权基因共表达网络分析）揭示了两种主要的基因表达模式：短期响应（381个基因）和长期响应（364个基因）。DEGs富集分析表明，参与氮（N）代谢、硫转运蛋白和氨酰-tRNA生物合成的基因表达显著上调，为初期合成金属螯合蛋白、抗性金属蛋白和转运蛋白（ABC转运蛋白）的重要组分（半胱氨酸）提供了原料，是一种短期响应机制。前15分钟的Cd吸附主要依赖于膜转运蛋白和预先蓄积的EPS。同时，上调的谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）家族蛋白在外源性镉的初始抗性中发挥作用。受损的光合系统在后期得到修复，糖酵解和糖异生表达上调，满足生理代谢活动的能量和物质。本研究首次提供了微藻响应镉胁迫的短期和长期分子机制。同时，本研究中鉴定的关键基因可以作为藻类基因工程的潜在靶点。

图形摘要

背景：

由于工业化、城市化和技术发展，重金属污染是全球最严重的环境污染问题之一。镉（Cd）作为一种主要重金属污染物，即使在低浓度下也毒性高、流动性强且难以降解，不仅对水生生物和土壤环境构成威胁，而且通过食物链的蓄积对人类健康有害。

蓝藻是光自养微生物，对重金属具有很强的富集能力和对污染物的敏感响应，被广泛用作生物修复材料，用于处理重金属污染物和评估水生系统中重金属的风险。蓝藻最显著的优势之一是能够产生EPS，EPS可以用作重金属吸附。然而，关于EPS在重金属吸附中的作用以及相关的分子机制，目前仍知之甚少。

微藻已发展出一系列防御机制来响应重金属胁迫引起的氧化损伤，如金属排泄、金属螯合物合成和抗氧化系统激活，金属硫蛋白（MTs）和植物螯合蛋白（PCs）通过螯合游离金属形成镉络合物在镉解毒中发挥重要作用。微生物对镉胁迫响应是镉多种调节机制的结果。尽管此前有研究对集胞藻PCC6803进行全基因组测序，然而，集胞藻PCC6803对镉胁迫响应机制的纵向时间轴变化尚不清楚。本研究通过EC50值下的微藻生长状态、镉吸附率、EPS含量、叶绿素含量、抗氧化剂（谷胱甘肽）和ROS水平的动态变化，结合RNA-seq分析，鉴定出微藻对镉耐受和防御的关键基因和响应途径。这些结果有助于进一步阐明集胞藻PCC6803对镉胁迫短期和长期响应分子机制，为培养抗重金属胁迫的蓝藻工程提供理论依据。

方法：

微藻（集胞藻PCC6803）在含有BG-11培养基的锥形瓶中生长，并在光培养箱中静态培养。将CdCl2.2½H2O加入无菌水中制备1.0 g/L的 Cd2+溶液。Cd2+溶液通过0.2μm孔滤器过滤消毒。将Cd2+溶液添加到含有100 mL培养基的锥形瓶中，使终浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/L，将不含Cd2+的培养基用作对照。用血细胞仪计算不同镉浓度下的细胞数。所有实验均设置三个生物学重复。为确保胁迫效应和生长状态，选择EC50值实验。

RNA文库制备测序分析

用0.5 mg/L Cd（EC50值）处理的微藻样品在0、15 min、48 h、72 h和96 h不同阶段收集在50 mL Falcon管中，并在4°C下以8000 rpm的转速离心5分钟。分离沉淀物并在无菌水中洗涤两次后立即在液氮中冷冻，并在-80°C下储存，直到提取RNA，所有实验均设置三个生物学重复。

易基因提供的原核转录组测序分析，是针对检测原核菌个性化设计rRNA去除探针，利用高通量技术对原核细胞所产生的所有mRNA和sRNA（非编码RNA）进行测序。系统全面解析特定细胞所产生的mRNA和sRNA对生物性状的影响。

RNA-seq测序分析结果

为研究集胞藻PCC6803对Cd胁迫的分子机制，作者通过高通量RNA-seq进行比较转录组分析。从微藻的三个生物重复中构建了包含五个处理组的15个cDNA文库进行测序分析。

图1：主成分分析（A），差异基因表达的聚类热图（B），不同时间点（0h，15min，48h，72h，和96h）Cd胁迫的差异基因表达WGCNA分析，微藻共表达模块的聚类树（C）。特征表达趋势（D）（E）

图2：Cd胁迫下微藻基因表达谱变化

图3：光合作用DEGs基因表达模式热图

关于易基因原核转录组测序(mRNA+sRNA)

原核转录组测序可以从基因表达量、基因结构和sRNA调控功能三维度揭示不同生物性状的分子调控机制。如通过计算各组间的差异基因并对差异基因进行富集分析，获得对生物性状影响较大的通路信息；通过预测基因的反义转录本，丰富基因组注释内容；研究sRNA对mRNA的相互作用，从分子调控角度解释生物性状之间的差异。

易基因针对检测原核菌个性化设计rRNA去除探针，利用高通量技术对原核细胞所产生的所有mRNA和sRNA（非编码RNA）进行测序。系统全面解析特定细胞所产生的mRNA和sRNA对生物性状的影响。

技术优势：

• 针对原核生物设计去除rRNA专属探针，rRNA去除效果好。
• 同时分析sRNA与mRNA的互作关系，更加全面解读表达互作网络。

研究方向：

原核转录组测序是专业针对原核微生物设计开展的转录组学研究。

• 基因表达量分析
• 差异基因鉴定
• 非编码RNA鉴定等

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