DNA琼脂糖凝胶电泳原理

琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA的方法,这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物,利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应,达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电,在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品,其中有三种构型的分子:共价闭合环状的超螺旋分子(cccDNA)、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA>IDNA>ocDNA

    核酸分子是两性解离分子,pH3.5是碱基上的氨基解离,而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离,所以分子带正电,在电场中向负极泳动;而pH8.0-8.3时,碱基几乎不解离,而磷酸基团解离,所以核酸分子带负电,在电场中向正极泳动。不同的核酸分子的电荷密度大致相同,因此对泳动速度影响不大。在中性或碱性时,单链DNA与等长的双链DNA的泳动率大致相同。

图片摘自网上
图片摘自网上

影响核酸分子泳动率的因素主要是:

1、样品的物理性状

即分子的大小、电荷数、颗粒形状和空间构型。一般而言,电荷密度愈大,泳动率越大。但是不同核酸分子的电荷密度大致相同,所以对泳动率的影响不明显。

对线形分子来说,分子量的常用对数与泳动率成反比,用此标准样品电泳并测定其泳动率,然后进行DNA分子长度(bp)的负对数­——泳动距离作标准曲线图,可以用于测定未知分子的长度大小。

DNA分子的空间构型对泳动率的影响很大,比如质粒分子,泳动率的大小顺序为:cDNA>IDNA>ocDNA但是由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和溴化乙锭等的影响,会出现相反的情况。

2、支持物介质

琼脂糖是一种聚合链线性分子。含有不同浓度的琼脂糖的凝胶构成的分子筛的网孔大小不同,适用于分离不同浓度范围的核酸分子。选择不同浓度的凝胶,可以分离不同大小范围的DNA分子。

3、电场强度

电场强度愈大,带点颗粒的泳动越快。但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小,所以电泳时一般采用低电压,不超过4V/cm。而对于大片段电泳,甚至用0.5-1.0V/cm电泳过夜。进行高压电泳时,只能使用聚丙烯酰胺凝胶。

4、缓冲液离子强度

核酸电泳常采用TAE、TBE、TPE三种缓冲系统。TAE价格低廉,但缓冲能力低。TPE在进行DNA回收时,会使DNA污染磷酸盐,影响后续反应。所以多采用TBE缓冲液。

在缓冲液中加入EDTA,可以鳌合二价离子,抑制DNase,保护DNA。

缓冲液pH常偏碱性或中性,此时核酸分子带负电,向正极移动。

核酸电泳中以前常用的染色剂是溴化乙锭(ethidium bromide EB)。BE见光分解,应在避光条件下4℃保存。溴化乙锭是一种扁平分子,可以嵌入核酸双链的配对碱基之间。在紫外线照射BE-DNA复合物时,出现不同的效应。254nm的紫外线照射时,灵敏度最高,但对DNA损伤严重;360nm紫外线照射时,虽然灵敏度较低,但对DNA损伤小,所以适合对DNA样品的观察和回收等操作。300nm紫外线照射的灵敏度较高,且对DNA损伤不是很大,所以也比较适用。但EB有毒,现实验室已基本不用,用核酸燃料代替EB。

1、若使用溴化乙锭(EB)需注意安全,EB为中度毒性、强致癌性物质,务必小心,勿沾染于衣物、皮肤、眼睛、口鼻等。所有操作均只能在专门的电泳区域操作,戴一次性手套,并及时更换。

2、预先加入EB时可能使DNA的泳动速度下降15%左右,而且对不同构型的DNA的影响程度不同。所以为取得较真实的电泳结果可以在电泳结束后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色。若胶内或样品内已加EB,染色步骤可省略;若凝胶放置一段时间后才观察,即使原来胶内或样品已加EB,也建议增加此步。

3、制胶若形成气泡需在凝胶液未凝固之前及时清除,否则,需重新制胶;上样时也不要有气泡,容易使样品飘散。

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