2021-12-31

Nature| 瘤内异质性的高分辨率多组学表征

原创 风不止步 图灵基因 2021-12-31 09:12

收录于话题#前沿分子生物学技术

撰文：风不止步

IF=49.962 

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亮点：

人们对肿瘤克隆在组织内是如何组织的，以及癌症的发展在多大程度上是由克隆特异性遗传畸变或环境线索驱动的仍然知之甚少，依然需要有新的方法来整合基因组、转录组和空间的规模测量。作者开发了一种能够从完整组织中进行空间分辨率DNA测序的方法slide-DNA-seq，是一种可扩展的技术，使用条形码珠子阵列来捕捉空间分辨率的全基因组表达。

2021年12月15日，美国布罗德研究所的Jason D.Buenrostro博士等人在《Nature》上发表了一篇“Spatial genomics enables multi-modal study of clonal heterogeneity in tissues”的文章，文章表明最近开发的原位基因组测序能够对DNA进行无目标的空间测量，但侧重于染色体结构的高分辨率成像，不包括对组织切片的分析。slide-DNA-seq可以检测克隆的异质性，描述每个克隆的拷贝数改变，并分析它们在组织内的空间分布。这些能力结合组织病理学的连续切片处理和slide-RNA-seq，可以对瘤内异质性进行高分辨率的多组学表征。此外，与单细胞全基因组测序相结合，可以对复杂的亚克隆事件进行空间表征，如杂合度的丧失或染色体外DNA扩增。

首先生成一个3mm珠子的空间索引阵列，每个10微米的聚苯乙烯珠子都含有一个独特的DNA条形码，对应于一个空间位置，并通过结扎化学测序来读出。然后对组织进行冷冻，并将一个10μm厚的新鲜冷冻切片转移到测序珠阵列上（图1a）。为了能够无偏差地捕获DNA，用盐酸处理组织切片以去除组蛋白，并用Tn5转位以创建基因组片段，其两侧为定制的适配器序列。然后从珠子上光解空间条码，将其与近端基因组片段连接，并对产生的DNA测序库进行PCR扩增（图1b）。文库构建后开始进行高通量的成对端测序，并使用DNA条形码将每个基因组片段与珠子阵列上的空间位置联系起来。这些关联能够重建组织中DNA的空间组织，而无需在显微镜下对样品进行成像。开发组织固定、组蛋白去除和桥式寡核苷酸杂交的优化方法，这些方法共同使库的大小最大化，使染色质被Tn5均匀地访问，并保留组织结构。经过最初的优化，每个阵列包含20,000到40,000个珠子，每个珠子有165到421个片段（肿瘤组织）的中间值。此外，也开发一个概念验证的协议变体，使用重复的Tn5标记来提高产量，从而使基因组片段增加了10倍。

为确定这种方法的空间和基因组分辨率，首先将Slide-DNA-seq应用于小鼠小脑，小脑含有明显的细胞核密集（体细胞）和线粒体丰富（神经元）的区域（图1c）。推断，这些模式应该反映在核与线粒体DNA片段的空间分布上。事实上，从Slide-DNA-seq数据中可以看出核与线粒体DNA含量的条纹（图1d）。然后用这些模式来测量空间分辨率，对同一小脑的连续组织切片进行免疫荧光和DAPI染色，结果是横向扩散估计约为25微米（图1e）。这些数据共同表明，Slide-DNA-seq可以在正常组织内对基因组信息进行空间定位。

接下来应用Slide-DNA-seq来测量肿瘤切片中拷贝数改变（CNAs）的空间分布，使用的是已知存在染色体扩增和缺失的肺腺癌基因工程小鼠模型。首先，从KrasG12D/+Trp53-/-(KP)小鼠肺部肿瘤中分离并扩增了一个肿瘤克隆，并将该克隆注射到小鼠尾静脉中，在肝脏中产生了大的转移（图1g）。然后，收集肝转移瘤的多个连续切片，进行滑动DNA测序，同时对HMGA2（一种晚期肿瘤标志物）进行染色和免疫荧光检查。为描述组织内的肿瘤异质性，我们开发了一个Slide-DNA-seq分析工作流程，包括两个主要任务。(1）克隆群体的从头识别和空间定位，以及（2）每个克隆的基因组CNAs的特征。

首先，根据空间接近性对珠子数据进行了平滑处理，并进行主成分分析（PCA），以找到整个组织内覆盖率不同的共同相关的基因组区域。当将这种方法应用于来自肝转移瘤的Slide-DNA-seq阵列时，主成分1显示出空间模式化（图1h），与针对晚期肿瘤标记HMGA226-28的连续切片的免疫荧光（图1i）在视觉上是一致的。为验证这种方法是否可以用来识别遗传上不同的肿瘤克隆，我们对4个肿瘤细胞系的批量测序进行采样，发现每个样本只有1,000个片段就有强大的准确性（99.38%），这表明这种策略对Slide-DNA-seq数据是足够的。

分析工作流程中的第二个任务是确定每个肿瘤克隆中存在的RNA的特征。为做到这一点，根据第一项任务中的聚类分配，将数百到数千个原始珠子的数据汇总起来，并以1Mb的分辨率对每个聚类的基因组覆盖进行可视化。当应用于肝转移瘤阵列时，肿瘤相关群显示出明显的CNAs，包括Kras诱导的肺肿瘤特有的6号染色体的扩增，而正常群则显示出相对均匀的覆盖（图1j）。与在连续切片上进行的生物复制品的进一步比较显示了视觉上一致的组织结构，以及肿瘤拷贝数概况之间的高度相关性。为了量化拷贝数分析的准确性，使用二倍体小鼠小脑数据来系统地评估在一系列的bin大小和空间分辨率的覆盖率。这些结果表明，Slide-DNA-seq分析工作流程能够在大约1兆字节的基因组分辨率下从头发现和定位肿瘤区域。

为证明实验和计算方法可以区分组织内的克隆，将源自两个独立衍生的转移性KP肿瘤的多个克隆注射到小鼠的尾静脉中，这在肝脏中产生了大的转移灶。然后进行H&E染色确定组织的一个区域似乎有两个空间上不同的转移灶（图2a）。在同一区域的连续切片上进行免疫组化，发现这两个肿瘤标志物HMGA226的蛋白水平不同，表明它们可能来自不同的转移克隆。

然后对同一肝组织的第三个序列切片进行了滑动DNA测序。使用PCA方法发现PC1和PC2都解释了大量的方差（分别为4.21%和2.50%），允许根据其基因组图谱将这些珠子分配到3个不同的集群中（图2b）。其中一个集群在视觉上与正常组织的H&E染色相一致，而另外两个似乎与不同的转移灶相对应。作者开发一个置换测试，对存在于一个或两个转移灶中的具有统计学意义的RNA增量或减量进行空间定位，并在chr6、chr15和chr19检测到不同的区域（图2c）。

为测试两个克隆之间的遗传差异是否反映在细胞状态上，在第四个连续切片上进行了slide-RNA-seqV220，并收集配对的单核RNA测序（snRNA-seq）。snRNA-seq数据的无监督聚类和空间投影到slide-RNA-seq珠上，发现两个转移灶的转录是不同的（图2e）；两个克隆之间有3732个基因的差异表达（图2f）。克隆A具有较高的晚期肿瘤标志物的表达，包括Hmga2（肺转移）、Tm4sf1（JAK-STAT信号）和Vim（细胞运动），而克隆B的最高命中率包括Aqp5（系别丧失）和上皮-间质转化标志物S100a4和Vcan25（图2f, g）。虽然两个克隆都表现出上皮向间质过渡和转移的表达特征，但这些不同表达的基因可能反映了肿瘤进化的不同路径。总之，数据表明：配对的Slide-DNA-seq和slide-RNA-seq能够对遗传上不同的转移性肿瘤克隆及其相关的细胞状态进行空间特征分析。

Slide-DNA-seq将对创建肿瘤进化图谱的大规模工作特别有用，为克隆异质性的研究增加空间信息。它还可能推动临床诊断的新领域，作为H&E染色、核型和DNA荧光原位杂交等标准病理检测的补充。空间分辨率的DNA测序也可能使癌症基因组学以外的许多领域取得进展，包括空间分辨率的元基因组学、评估基因疗法的传递、合成DNA数据存储和健康组织的血统追踪。技术核心即在原地对DNA进行片段化和条码化，为下一代测序保留空间信息，且与其他基于测序的检测方法兼容。总之，Slide-DNA-seq为绘制人类发育、平衡和疾病中细胞状态的空间组织提供了新的机会。

教授介绍

Jason D. Buenrostro，博士

Jason Buenrostro是麻省理工学院和哈佛大学博德研究所的准成员，也是哈佛大学干细胞和再生生物学系的助理教授。Buenrostro试图了解细胞如何获得和逆转表观遗传变化以及这些变化如何导致疾病。为此，Buenrostro 正在开发以单细胞分辨率测量基因调控动态的新方法。他还共同领导了 Broad 的基因调控观察站。

参考文献

Tongtong Zhao, Zachary D. Chiang et al.Spatialgenomics enables multi-modal study of clonal heterogeneity in tissues(2021)