Nature Methods | 基因编码的化学传感器敏感性提升10倍，实现亚细胞分辨率
原创 骄阳似我 图灵基因 2022-11-08 10:11 发表于江苏
收录于合集#前沿分子生物学技术
撰文：骄阳似我
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亮点：
本文筛选了现有的基因编码的cAMP传感器，并进一步开发了表现最好的传感器，以获得三种改进的变体，称为cAMPFIREs。与它们的亲本传感器相比，这些传感器对cAMP和细胞质分布的敏感性增加了高达10倍。cAMPFIRE与比率成像和荧光寿命成像兼容，并且可以检测生理相关的纳摩尔浓度下由去甲肾上腺素引起的cAMP动力学。
环腺苷单磷酸（cAMP）信号整合了来自多种G蛋白偶联受体的信息，如神经调节受体，以细胞特异性和亚细胞特异性的方式调节关键的生物过程。然而，cAMP动力学的体内细胞分辨率成像仍然具有挑战性。
近期，在Nature Methods 杂志上发表了一篇名为“Sensitive genetically encoded sensors for population and subcellular imaging of cAMP in vivo”的文章，比较了人类胚胎肾（HEK）-293细胞中现有的cAMP传感器，包括基于Förster共振能量转移（FRET）和基于强度的传感器。确定了表现最好的，并进一步设计了三种增强型变体，命名为cAMPFIREs。
与亲代传感器相比，cAMPFIRE对cAMP的敏感性增加了10倍，并且可以检测由生理相关的纳摩尔浓度的去甲肾上腺素引起的cAMP动力学。这些传感器表现出改善的，甚至亚细胞分布和减少的蛋白质聚集。重要的是，cAMPFIREs与比率和荧光寿命成像显微镜（FLIM）方法兼容。这些传感器允许在小鼠第2/3层（L2/3）皮层神经元中进行双向cAMP动态的纵向体内成像，具有单细胞和亚细胞分辨率。结果显示，皮层神经元中cAMP的强直水平依赖于清醒状态，由肾上腺素能受体以神经元隔室特异性方式调节，并受到吗啡的影响。动物运动触发不同L2/3神经元中cAMP的细胞特异性上调或下调。
筛选现有的cAMP传感器
本文共评估8个传感器，它们对生理配体去甲肾上腺素（1 μM）的反应和最大动态范围由腺苷环化酶激动剂福斯柯林（25 μM）和磷酸二酯酶抑制剂IBMX（50 μM）引起（图1a，b）。为了比较不同的成像方式，将各自基线的比值（即∆Ratio/Ratio0或∆F/F0）标准化（图1c-e）。
Epac-SH187突出有三个原因。首先，它对去甲肾上腺素的动态范围最大，反应范围第二大（图1d，e）。第二，与其他相比，Epac-SH187在整个实验中表现出快速且一致的响应（图1d，e）。第三，使用mTurquoise2作为FRET供体，具有单指数荧光寿命。这使得该传感器也适用于FLIM，它具有在脑组织和慢信号动力学（≥秒）方面的优势。然而，Epac-SH187有两个局限性。首先，其对去甲肾上腺素的反应仅为其动态范围的22%，表明其具有中等的敏感性（图1d，e）。第二，其在细胞中采用了不均匀的核周分布，并表现出形成聚集的高倾向。图1：现有cAMP传感器的筛选。
纠正不均匀的亚细胞分布，提高响应灵敏度
首先纠正Epac-SH187不均匀的亚细胞分布。其亲本蛋白Epac1通过一个凌乱的Egl-10和Pleckstrin（DEP）结构域定位到细胞膜上，并通过一个核孔定位（NPL）序列定位到核周结构（图2a）。在Epac-SH187中，DEP结构域被去除，但NPL序列保留（图2a、b），导致核周定位（图2c、d）。这对传感器来说是不可取的，而且影响细胞功能，传感器存在于内源性Epac的位置，可能会导致显性负效应。系统诱变导致两组突变，破坏了核周定位（图2c–e）。当在多种神经元类型中表达时，该变异也表现出均匀的胞质分布（图2f）。
接下来解决敏感性不足的问题。Epac-SH187的cAMP半最大有效浓度（EC50）为~3.8 μM，比细胞内生理cAMP浓度范围（~1 μM）和PKA的cAMP结合亲和力高出几倍。本文探索了两种方法。首先，检测了Epac2 CNB-B结构域的结构，该结构域相当于Epac1中唯一的CNB结构域（图2a）。第一轮诱变发现一个突变（M312F）消除了传感器响应，表明M312发挥了关键作用。在该位置进一步随机突变发现了几个去甲肾上腺素反应增加的突变体，M312L表现出165±15%大于Epacc-SH187（图2g，h）。其次测试了已知能够增强环状核苷酸门控（CNG）通道中配体亲和力的突变。其中，E325的几个突变增加了对去甲肾上腺素的反应，其中E325T的反应最大（图2g，h）。
将“离域”突变（L777A/K778A）或没有或与M312L或E325T结合起来，得到了三个改进的传感器（图2g），cAMPFIRE-L、cAMPFIRE-M和cAMPFIRE-H分别重命名为低、中和高亲和力（图2g，h）。为了量化它们对去甲肾上腺素的敏感性确定了浓度-反应曲线。在每个实验中只提供一个剂量的去甲肾上腺素，以减少潜在的适应，并对福斯柯林和IBMX引起的相应最大反应的反应归一化（图2i，j）。去甲肾上腺素可以在10 nM浓度下触发生理反应。然而，Epac-SH187的EC50为14.5 ± 8.8µM（图2i-k），高出两个数量级。cAMPFIRE-L、cAMPFIRE-M和cAMPFIRE-H的灵敏度分别提高了9倍、72倍和177倍（图2k）。可以检测到低至10 nM的去甲肾上腺素所引发的反应。由福斯柯林和IBMX引起的cAMPFIREs的动态范围只有适度的变化（图2l）。
图2：cAMPFIREs的发展。
表征其特异性和特性
首先在HEK细胞中系统地描述了cAMPFIREs的特性。cAMPFIRE-L对去甲肾上腺素的反应为当突变了一个与cAMP结合所必需的残基时，它就会消失（R279E；图3a）。这种反应是可逆的，并能被β-肾上腺素受体拮抗剂普萘洛尔（1µM）阻断（图3b）。为了确定可实现的动力学，在HEK细胞中表达cAMPFIRE-L，并给予短时间（10秒）去甲肾上腺素。观察到温度依赖的动力学和非动力学，温度系数（Q10）分别为2.2和1.6（图3c，d）。通过外推，估计上动力学和外动力学分别为6.2 s和13.8 s。这些动力学比CA1神经元中对cAMP和PKA的反应具有生理特性的慢后超极化（sAHP）要快。
接下来研究传感器蛋白的性质。纯化在昆虫细胞中表达的cAMPFIRE-L，并测定其在没有和存在1 mM cAMP的情况下的发射光谱（图3e）。纯化的蛋白的kon为0.14µM−1s−1，cAMP的koff为1.7s−1（图3f）。对于2µM的cAMP，这相当于2.5 s的半kon和0.4 s的koff。为了确定cAMP的亲和力和特异性，通过一个带有21个残基连接子的羧基末端Myc标记，将HEK细胞表达的传感器免疫沉淀并固定到琼脂糖珠上。亲本传感器的cAMP亲和力为3.7 ± 0.3µM。cAMPFIRE-L、cAMPFIRE-M和cAMPFIRE-H对cAMP的敏感性增加了10倍（图3g、h)。这些传感器的Hill系数低于1（图3g），与Epac1的cAMP结合相一致，可能反映了cAMP结合下游的额外构象变化。
值得注意的是，cAMP反应被R279E cAMP结合突变所消除（图3i）。cAMPFIREs对环磷酸鸟苷（cGMP）的反应很小（图3g）：在1000µM的cGMP时，所有传感器的响应都低于其各自最大响应的50%。局部曲线的强制拟合得到cGMP EC50值cAMPFIRE-L、cAMPFIRE-M和cAMPFIRE-H分别为56000±16000µM、30100±19000µM和5000±550µM，比cAMP的相应亲和力高出10000多倍。总的来说，cAMPFIREs专门检测cAMP的亚微摩尔灵敏度和动力学在秒量级。图3：HEK细胞和纯化蛋白中cAMPFIREs的特征。
脑组织神经元cAMP动态检测
为了在大脑中进行体内成像，探究cAMPFIREs是否可以检测脑组织内神经元中的cAMP动态。在体内成像实验中，使用2pFLIM来测量FRET，因为它在脑组织中具有优势。与Epac-SH187相比，CA1神经元中cAMPFIREs的反应振幅显著增加（图4a，b）。同样，在L2/3锥体神经元中，cAMPFIRE-L和cAMPFIRE-M对浓度低至10 nM的去甲肾上腺素反应强烈（图4c，d）。这些响应值是亲本传感器的3倍。这表明L2/3神经元表现出一个静息水平的cAMP，足以轻度激活cAMPFIRE-M，表明cAMPFIREs能够敏感地检测神经元中的cAMP。
为了检验cAMPFIREs是否影响神经元功能，对培养的海马切片中的CA1神经元进行了全细胞记录（图4e-g）。cAMP和PKA参与了许多神经元功能，如突触AMPA受体含量、突触密度和sAHP。重要的是，sAHP对去甲肾上腺素的调节，一个由cAMP和PKA41介导的过程，没有改变（图4g）。因此，在本文的条件下，cAMPFIREs的表达似乎并没有改变神经元的功能。图4：脑切片神经元中cAMPFIREs的特征。
清醒小鼠cAMP的纵向和亚细胞成像
为了测试cAMPFIREs的体内成像，在体感皮层的L2/3锥体神经元中表达cAMPFIRE-L或cAMPFIRE-M，并在清醒的小鼠中通过开颅植入光学窗口进行2pFLIM。单个神经元可以被清晰地分辨出来，并在几个月内反复成像（图5a）。单个神经元在几周内的基础寿命是相关的（图5b）。与神经调节剂被清除的急性切片相比，cAMPFIRE-L和cAMPFIRE-M在体内均表现出更高的基础寿命，这表明存在额外的cAMP紧张性水平（图5c）。神经元树突也可以被分解，并且比相应的体细胞具有更高的寿命（图5d），这表明强直性cAMP水平是特定于单个亚细胞隔间的。
动物的清醒状态与大脑皮层中神经调节剂如去甲肾上腺素水平的升高有关。探究清醒是否会影响紧张性cAMP。使用cAMPFIRE-L测量，异氟烷暴露（1.5%）降低了神经元体细胞中的cAMP水平（图5e，f）。这种反应是可逆的和可重复的（图5f）。值得注意的是，cAMPFIRE-L的响应振幅显著大于Epac-SH187检测到的结果(图5f，g)。在基线中，所有表达cAMPFIRE-L的细胞都表现出可检测到的反应，而只有38%的表达Epac-SH187的神经元表现出反应（图5h）。这些结果表明，cAMPFIREs能够检测到以前无法识别的cAMP动态。
为了检测基础cAMP张力是否由去甲肾上腺素介导，在单独的实验中给小鼠腹腔注射α2-肾上腺素能拮抗剂育亨宾（5mgkg−1）或β拮抗剂普萘洛尔（25mgkg−1）。这两种受体都在啮齿动物皮层中表达。育亨宾导致神经元树突中cAMP浓度增加，但对神经元体细胞影响不大（图5i)。相比之下，普萘洛尔同时降低了体细胞和树突中的cAMP，但对树突的影响更大（图5i）。为了检测其他神经调节途径引起的cAMP调控，给予吗啡（25mgkg−1）激活在皮质L2/3神经元中表达的µ-阿片类受体。吗啡注射导致cAMP活性降低，使给药40分钟后~趋于稳定（图5j，k）。作为对照，与cAMP结合的突变体在这些条件下几乎没有表现出什么反应（图5k）。图5 : cAMPFIREs可实现纵向体内成像。
cAMPFIRE可能在基础和临床研究中有广泛的应用。cAMPFIRE-H即使在HEK细胞中，基线也开始增加，可能已经达到了对细胞内成像的有用敏感性的极限。然而，更大的动态范围可能会减少对光子预算的需求，从而适用于长时间成像或更具挑战性的实验，如在脑深部区域成像，对较小的cAMP事件的可视化，以及在小神经元室的事件。
教授介绍：
钟海宁，博士
钟海宁于1996年获得清华大学生物科学与生物技术学士学位和电子与计算机科学学士学位。他于2002年获得约翰霍普金斯大学医学院神经科学博士学位。钟海宁在冷泉港实验室进行了博士后培训，然后在霍华德休斯医学研究所的珍妮莉亚农场研究园区进行了博士后培训。2010年，他被任命为Vollum研究所的助理科学家，并于2015年晋升为科学家。
他主要研究大脑是如何被调节和改变的，以使动物适应并在不断变化的世界中脱颖而出。他的重点是两种类型的调节 - 神经调节和经验依赖性可塑性 - 使用啮齿动物作为实验模型。根据具体问题，使用各种方法利用体外和体内实验的优势，包括先进的显微镜、电生理学、光遗传学、小鼠遗传学、基于 CRISPR 的基因编辑和计算。
参考文献：
Massengill, C.I., Bayless-Edwards, L., Ceballos, C.C.et al.Sensitive genetically encoded sensors for population and subcellular imaging of cAMP in vivo.Nat Methods(2022). https://doi.org/10.1038/s41592-022-01646-5