细胞培养技巧

  1. 培养基里的“四大金刚”—MEM、DMEM、1640、F-12
    它们基本参与了90%以上种类细胞的培养过程。

MEM

作为带头大哥,能力非常全面,号称是应用最广泛的细胞培养液。

DMEM

作为随时紧跟老大MEM的二弟,青出于蓝而胜于蓝,浓度要高出2~4倍,可分为高糖型(含葡萄糖4500mg/L)和低糖型(含葡萄糖1000mg/L)。

1640

老三中规中矩,营养成分比较简单,比DMEM少一点糖和谷光甘肽,常用于淋巴细胞的培养。

F12培养基

起初是作为一种无血清配方设计的,常补加血清用于支持各种正常的和转化细胞的增殖。F12常和DMEM以I:I结合,称为DMEM/F12培养基,作为开发无血清配方的基础,以利用F12含有较丰富的成分和DMEM含有较高浓度的营养成分的优点。
小兄弟F12常用来支持CHO、Hela和L-细胞生长以及原代大鼠肝细胞和前列腺上皮细胞的培养。MEM和F12 这两种培养基各取1/2,即可形成神经生物学最通用的培养基。
在此,奉送一个不同细胞系对应的不同培养液的图,供大家参考。

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  1. 细胞生长的空间密度是细胞培养的关键。具体养细胞时应该摸索细胞喜欢的生长空间密度,即不能让细胞瓶里的细胞因拥挤不堪而萎靡不振;也不能让细胞浓度低于1~5×105个/mL而导致“孤独死”(因为细胞的健康生长需要细胞间的连接)。因而细胞接种前,要先通过细胞计数来调整细胞浓度。

  2. 当培养的贴壁细胞形态不好时,可在传代时,先倒掉旧的培养基,加入3ml新的培养基(有无血清都可以)洗涤一次,用滴管吸走,再加入3ml培养基,沿着瓶底轻轻吹打一遍,然后吸走。这时再正式进行消化、吹打。

其次,把吹打下的细胞悬液加入到含有新培养基的培养瓶内,置于培养箱里培养,按时间点观察细胞贴壁情况(10min,20min,30min)。而后迅速倒出其中的培养基,加入3ml新培养基再轻轻洗一次,然后加入完全培养基培养并观察细胞生长情况以及形态。直至找到细胞完美的形态为止。

  1. 至于在培养瓶中加入多少培养基量,则需要实验汪们自己去摸索的。对于生长快的细胞,易生长的细胞加少一点培养基,细胞形态会更好,但是要注意对换液时间的把握。

  2. 如何选择培养瓶:一般,生长速度慢的细胞如果想要更漂亮的细胞状态,那么采用塑料瓶会比玻璃瓶的效果好;生长速度快的细胞,用玻璃瓶培养的效果会更好。因此,对于同一种细胞,在其生长速度慢的时候(比如细胞刚复苏时或者原代培养),塑料瓶会好一点;而在其生长旺盛的时候,玻璃瓶则相对会好一点。

  3. 细胞冻存时,盖子要拧紧,不然复苏水浴时会渗水,造成细胞污染。因而冻存管要选择原配的管子和盖子(不同牌子、型号的管子会有差别),盖子拧紧后最好用封口膜封住。且每支冻存管都要标上细胞的名称、冻存时间,并记录在册,以免后续复苏细胞时,取错细胞。

  4. 细胞冻存时要严格进行梯度降温(-4℃→-20℃~-40℃→-80℃→液氮)。要知道冰火两重天的生活环境只会让娇弱的细胞自爆身亡,谨记:缓降温!但如果真心赶时间时,可使用细胞冻存盒进行细胞冻存,而后尽快将其转入液氮中。此外,要定期测量液氮罐里的液氮储备,以保证细胞全部浸在液面下。

  5. 细胞解冻时,由于冻存管管壁较厚、隔热,而导致水浴时间太长(2min还没融化)时,可以将水浴锅的温度调至40℃左右,可以缩短解冻时间。

  6. 提前预定超净台,减少复苏后插在冰盒里等待的时间,可避免细胞房人满为患,超净台使用紧张,复苏1h后,还没有加入新的培养液。(高浓度DMSO防止胞内形成冰晶,冻存时保护细胞,但复苏融解后,浸泡时间太久会对细胞有毒性)

  7. 复苏细胞时一定要有耐心,因为有些细胞在复苏一星期后才会真正有起色。因而,尽管细胞在复苏三四天后没有任何动静,也不要轻易倒掉所有细胞,要耐心等待,两周后再做决定。

  8. 有关DMSO的一些注意事项:

DMSO能够快速穿透细胞膜进入细胞中,降低冰点、延缓冻存过程,同时提高细胞内的离子浓度、减少细胞内冰晶的形成,从而减少细胞损伤程度。

DMSO在溶解过程中会放热,应先与培养基混匀后再加血清,同时冻存液最好提前配置,DMSO现配对细胞的毒性可能更大;

复苏时,要离心去除DMSO,并用新鲜的培养基洗涤1-2次,注意离心的时候速度不要太快。

细胞培养小技巧今天就讲到这里。建议你可以先把这篇文章保存下来,当你遇到问题的时候再来看也许会更有感觉。

其实很多时候,我们是不清楚到底是哪方面出现问题的,这个时候就需要一步步去排除可能原因,切勿盲目地一次性改变多个条件。

转自公众号:解螺旋

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