石蜡包埋组织DNA的提取过程是怎样的？

操作步骤：

1. 请自行准备：无水乙醇、异丙醇、灭菌双蒸水、二甲苯及 1.5mL 离心管。

2. 取出洗涤液，按以下操作：

a) 洗涤液 A：按终浓度 30%的比例加入无水乙醇，如 7mL 加入 3mL 无水乙醇，14mL 加入 6mL 无水乙醇，充分混匀。

b) 洗涤液 B：按终浓度 70%的比例加入无水乙醇，如 3mL 加入 7mL 无水乙醇；6mL 加入 14mL 无水乙醇，充分混匀。

3. 样本处理：a) 取 5-8 μm 厚石蜡切片 5-10 张（含载玻片），65℃放置 10 分钟，放入装有二甲苯的玻璃瓶中，浸泡 10 分钟后，用手术刀或刀片，将组织刮下，放入 1.5 mL 离心管。b) 将 5-10 张石蜡切片（不含载玻片）直接放入装有 1.2 mL 二甲苯的 1.5 mL 离心管中，盖紧管盖，60℃金属浴 10 分钟，取出管子后震荡 10 秒，12,000 rpm 室温离心 2 min，彻底弃上清。 c）石蜡块：手术刀刮取 20-30 mg 石蜡包埋组织样本（尽量去除石蜡部分），放入装有 1.2 mL 二甲苯的 1.5 mL 离心管中，盖紧管盖，60℃金属浴 15 分钟，取出管子后震荡10 秒，12,000 rpm 室温离心 2 min，彻底弃上清。d）福尔马林固定、未包蜡样本：取 30 mg 样本，用手术刀尽量切碎，置于 1.5 ml 离心管中，加入 500 μL 灭菌双蒸水，涡旋振荡 20 秒， 12,000 rpm 离心 2 min，弃上清。重复 1 次，转步骤 6 处理。

4. 在上述处理过的脱蜡样本管中加入 1.2 mL 无水乙醇，旋涡震荡 30 秒，12,000 g 离心 2 分钟，弃上清（注意不要倒掉沉淀，少量乙醇可用吸水纸吸去，未包蜡样本不需此步）。

5. 开盖，室温放置 5 分钟，去除残留无水乙醇。

6. 加入 170 μL 裂解液 I，30μL 消化液，振荡混匀，56℃水浴至组织完全消化裂解。（一般为 30-60 分钟，皮肤、肺脏、子宫等结缔组织较多的切片应适当延长消化时间，最好消化至溶液中无可见的组织碎片。）

注意： 如需除去 RNA，可在加入裂解液后先加入 20μL BIOG DNase –Free RNase A(货号：51006)，振荡混匀，室温放置 5 分钟。再加入30μL 消化液，振荡混匀，56℃水浴至组织完全消化裂解。

7. 加入 200 μL 裂解液 II，振荡混匀，56℃水浴 5 分钟。

8. 加入 400μL 异丙醇，充分振荡混匀。将吸附柱放入收集管内，将混合物用移液器吸入吸附柱内，12,000 rpm 离心 2 分钟，弃收集管内废液。

9. 将吸附柱放回收集管内，加 500 μL 洗涤液 A 至吸附柱内，静置 2 分钟，12,000 rpm 离心 1 分钟，弃收集管内废液。

10. 将吸附柱放回收集管内，加 500 μL 洗涤液 B 至吸附柱内，12,000 rpm 离心 1 分钟，弃收集管内废液。

11. 将吸附柱放回收集管内，加 500 μL 洗涤液 B 至吸附柱内，12,000 rpm 离心 1 分钟，弃收集管内废液。

12. 将吸附柱放回收集管内，12,000 rpm 离心 2 分钟，离去残留的洗涤液。同时，按每份样本 30-50μL 取洗脱液（如 10 份提取样本，即取300-500μL 洗脱液），放置于灭菌 1.5mL 离心管，65℃预热。

13. 取出吸附柱，放入新的灭菌离心管内，加入 30-50 μL 预热的洗脱液，静置 2 分钟，12,000 rpm 离心 2 分钟，收集 DNA 溶液。提取的DNA 即可用于下一步实验或-20℃保存。

注意事项：

1、洗涤液在使用前应加入乙醇后充分混匀，最好现用现配，每次根据所需提取的样本量计算后适量配制。

2、本试剂盒提取 DNA 品质有赖于样本本身的质量，组织是否及时固定、固定时间、固定剂种类等均影响 DNA 的完整性。组织放置时间过长未及时固定、固定时间过长超过 24 小时、组织脱蜡不彻底、消化不完全等，都会影响 DNA 的得率和质量。

3、石蜡切片厚度不宜超过 8 μm，组织块应尽可能切碎或用液氮研磨，以便消化完全。

4、裂解液、消化液、洗涤液含有刺激性化学物质，操作过程请做好防护措施，避免直接接触皮肤，防止吸入口鼻。