蛋白质组学基础入门系列 |（三）蛋白质组学常用技术盘点（上）

基于质谱的蛋白质组学技术是生命科学领域十分常用的发现和验证工具。在进行日常科研工作时，经常在文献中看到各种各样的蛋白质组学技术专业名词，让人眼花缭乱、似懂非懂...

本讲内容就带大家梳理这些专业术语，盘点蛋白质组学的常用技术。

（蛋白质组学技术的专业名词）

我们在第一讲《蛋白质组学的基本概念》中提到过蛋白质组学研究的基本流程主要包含样品处理、质谱检测、数据分析三大阶段，以上这些词都可以对应到蛋白质组学研究流程的不同阶段中（如下图）。

（样品阶段和质谱阶段）

“样品阶段”的蛋白质组学技术是在样品准备或者处理过程中涉及的技术，本讲内容将它们分成基于标记的定量技术、非标记定量技术，以及做定量磷酸化蛋白质组时用到的富集技术三个部分来讲解。

基于标记的蛋白质组学定量技术

最早算作大规模定量蛋白质的技术是二十世纪70年代发展起来的双向电泳技术，2D-SDS-PAGE结合MALDI-TOF这种经典的组合在早期发现新的差异蛋白的研究中发挥过重要的作用。但是双向电泳操作繁杂、重复性很难控制，随着液质联用系统的发展，不基于凝胶的定量蛋白质组学方法开始发展起来了。这其中的典型代表SILAC技术，带火了基于稳定同位素标记的定量蛋白质组学技术。

SILAC技术，全称Stable isotope labeling by amino acids in cell culture，其原理如下图所示：将不同的稳定同位素标记的氨基酸添加到培养基中，分别用于培养不同条件下的细胞（比如对照组A、药物1刺激组B、药物2刺激组C），细胞在生长过程中将氨基酸整合到自身的蛋白中，不同标记的样品等比例混合后，经过一系列的处理过程，可以在质谱分析时区分同一种蛋白在不同条件下的相对含量的变化。

（基于SILAC标记的定量蛋白质组学技术）

SILAC技术可以降低系统误差，提高了定量的准确性，但是其劣势也比较明显。SILAC需要用到稳定同位素和特殊的血清进行细胞培养，成本很高；SILAC只能用来标记体外培养的细胞，不能用于组织等样品标记；SILAC最多只能同时标记三组样品，不能满足更多组样品同时比较的需求。为了克服这些不足，研究者们开发出了iTRAQ和TMT标记技术。

iTRAQ和TMT分别是SCIEX公司和Thermo公司推出的蛋白质组定量标记试剂盒，二者在试剂的分子设计及定量原理方面都是相似的。其标记试剂均由反应基团+平衡基团+报告基团三部分组成，每组试剂盒中的平衡基团+报告基团的质量之和保持一致，而报告基团的大小不同。

（iTRAQ和TMT标记试剂的分子结构）

以TMT标记为例来说明基于iTRAQ或TMT的定量蛋白质组学研究的基本流程。如下图所示，该研究想比较健康小鼠和疾病小鼠的肺组织的蛋白质组的差异。获取样品后，进行蛋白提取和酶解的步骤，得到肽段样品；在肽段水平，用TMT试剂中的不同标记通道来标记各个样品（其中“126,127,128,129”代表不同通道标记试剂报告离子的大小）；标记之后的样品等比混合，经过HPLC分成若干组分后，即可进入液质联用系统进行质谱检测和分析。质谱通过报告离子大小的不同可以实现区分不同样品以及对蛋白进行相对定量。

（基于TMT标记的定量蛋白质组学技术）

在质谱厂商的大力推动下，iTRAQ和TMT技术目前还在持续的发展中，尤其TMT试剂，目前已经可以做到同时标记18组样品，为我们常规的定量蛋白质组学研究提供了很大的帮助。

随着质谱性能的持续提升，以及科学家对大队列样品（比如临床样品）进行蛋白质组学分析需求的日益增长，基于标记的方法变得不必要和不现实，非标记定量技术正逐渐大放异彩。

非标记定量技术

非标记定量（Label-free quantification, LFQ）很好理解，即不需要对样品进行任何标记操作，直接分别对每个样品进行样品处理和质谱检测，得到每个样品各自的质谱数据后一起进行分析得到蛋白的定量信息。

（非标记定量技术）

随着质谱硬件性能的提升以及新的质谱扫描方式的发展，目前非标定量在检测深度和定量准确性方面已经接近或达到与标记定量相当的水平。此外，非标记定量的操作简单，不需要昂贵的标记试剂，可同时检测的样品数目又不受标记通道的限制。因此，非标记定量是定量蛋白质组学的必然趋势。

磷酸化肽段富集技术

磷酸化蛋白质组学（Phosphoproteomics）是指通过蛋白质组学技术对样品中的蛋白磷酸化修饰进行大规模鉴定和定量的研究。磷酸化蛋白质组学研究与蛋白质组学研究相比，技术层面的主要区别在于样品处理时多了一个磷酸化肽段富集的步骤。通过蛋白质组学技术大规模研究体内蛋白磷酸化修饰具有很大的挑战，因为磷酸化蛋白占比很低、处于动态变化的状态，且磷酸化肽段在质谱检测时的离子化效率较低。为了解决这些问题，需要在质谱检测前进行磷酸化肽段富集的步骤，目的是将样品中的非磷酸化肽段去除，富集留下磷酸化肽段，以便更多地检测磷酸化肽段和磷酸化位点。

IMAC和TiO2是目前磷酸化肽段富集最常用的方法，其原理是通过富集材料与带负电荷的磷酸化基团的分子间作用力将磷酸化肽段富集下来。此外，还可以使用磷酸化酪氨酸（pTyr）的泛抗体进行酪氨酸磷酸化肽段的富集，这种方法对于抗体的特异性要求很高。

（磷酸化肽段富集技术）

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