普通PCR、原位PCR、反向PCR和反转录PCR的 基本原理和操作步骤（三）

反向PCR

普通PCR、原位PCR、反向PCR和反转录PCR的 基本原理和操作步骤（三）

反向PCR(reverse PCR)是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段，而常规PCR扩增的是已知序列的两引物之间DNA片段.实验时选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段DNA进行酶切，然后用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连接，再用一对反向的引物进行PCR，其扩增产物将含有两引物外未知序列，从而对未知序进行分析研究.

反向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA。反向PCR可用于研究与已知DNA区段相连接的未知染色体序列，因此又可称为染色体缓移或染色体步移。这时选择的引物虽然与核心DNA区两末端序列互补，但两引物3’端是相互反向的。扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA，然后用DNA连接酶连接成一个环状DNA分子，通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段；现已制备了酵母人工染色体（YAC）大的线状DNA片段的杂交探针，这对于转座子插入序列的确定和基因库染色体上DNA片段序列的识别十分重要。

PCR只能扩增两端序列已知的基因片段，反向PCR可扩增中间一段已知序列，而两端序列未知的基因片段不扩增。

反向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA。反向PCR可用于研究与已知DNA区段相连接的未知染色体序列，因此又可称为染色体缓移或染色体步移。这时选择的引物虽然与核心DNA区两末端序列互补，但两引物3’端是相互反向的。扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA，然后用DNA连接酶连接成一个环状DNA分子，通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段；现已制备了酵母人工染色体（YAC）大的线状DNA片段的杂交探针，这对于转座子插入序列的确定和基因库染色体上DNA片段序列的识别十分重要。

该方法的不足是：①需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。②大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有时也会有这些序列，这样，通过反向PCR得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。

利用反向PCR可对未知序列扩增后进行分析，探索邻接已知DNA片段的序列，并可将仅知部分序列的全长cDNA进行分子克隆，建立全长的DNA探针。适用于基因游走、转位因子和已知序列DNA旁侧病毒整合位点分析等研究。

用传统的缓冲液和其他提供者推荐的条件裂解DNA。反向PCR所扩增的片段的大小由 PCR扩增片段的大小决定，目前，PCR扩增的实际上限为3-4kb。在许多情况下，首先 需要进行Southern杂交来确定内切酶用以产生大小适于环化及反向PCR的片段的末端 片段。能裂解核心区的内切酶使反向PCR只能扩增引物所定模板(依赖于引物)的上游 或上游区，而不裂解核心区的酶则使两上边侧序列都扩增，并带有由内切酶和环化类 型决定的接点(例如，互补突头连接与钝头连接)。对于扩增左翼或右翼序列，初试时 最好靠近识别上个碱基位位的酶，并已知在核心区有其方便的裂解位点。如果用反向 PCR从含有大量不同的克隆片段的同一载体中探测杂交探针，建议事先在载体中引入 合适的酶切位点。

用T4连接酶在稀DNA浓度下环化更容易形成单环。在一些实验中，为产生对反向 PCR大小适当的DNA片段需要两种内切酶，但这样所产生的片段末端则不适于连接，环 化前需用Klenow或噬菌体T4DNA聚合酶修理(钝化)。连接前，需用酚或热变性使内切 酶失活。

聚合酶链反应条件与经典所用的相同，例如，94℃-30秒变性，58℃-30秒引物退火， Taq聚合酶70℃延伸3分钟，进行30个循环。可改变PCR条件以生产特异产物。将反向 PCR用于测序时，与核心区末端后部结合的扩增引物更为有用，它使测序引物扩增部 分的核心序列与未知边侧序列间的接点更近，减少了扩增引物的干扰。

描述一种大聚合酶链反应应用的方法，使在已知序列的核心区边侧的未知成几何级数扩增。用适当的限制性内切裂解含核心区的，以产生适合于扩 增大小的片段，然后片段的末端再连接形成环状分子的引物同源于环上核心区 的末端序列，但其方向性，使链的延长经过环上的未知区而不是分开引物的核心区。这种反向方法可用于扩增本来就在核心区旁边的序列，还可应用于制备未知序列 探针或测定边侧区域本身的上、下游序列。