2022-07-18

Comm Bio | TAS-Seq提高单细胞测序准确性

原创 图灵基因 图灵基因 2022-07-18 09:04 发表于江苏

收录于合集#前沿分子生物学技术

日本科学家开发了一种新的DNA扩增和测序方法，可提高单细胞RNA测序（scRNA-seq）的准确性。这种称为TAS-Seq的新方法使用一种末端转移酶，该酶在基于纳米孔/磁珠的细胞分离平台上固相扩增和排序与mRNA（cDNA）互补的DNA。双脱氧核苷酸三磷酸（ddNTP）的使用终止了由末端转移酶催化的测序反应，并有助于减少变异和处理错误。

这一发现发表在《Communications Biology》杂志上的一篇文章中，标题为“TAS-Seq is a robust and sensitive amplification method for bead-based scRNA-seq”。作者包括东京理科大学的助理教授Kouji Matsushima博士。

新方法在确定组织中的细胞组成、基因检测的灵敏度、检测细胞间相互作用的稳健性、可溶性因子的检测以及由于使用序列终止子而易于处理方面要求更高的精度。这种使用简单材料和设备的技术进步可以为疾病和药物靶点提供新的见解，并引发空间和单细胞多组学方法的进步。

单细胞研究使人们有机会更深入地了解多细胞、异质生物系统的复杂性，而这是通过提供平均细胞读数的批量分析无法实现的。现有的技术，如基于液滴和平板的scRNA-seq，会影响单细胞样本的组成，并受到cDNA扩增限制的限制，这些限制会引入抽样偏差和倾斜scRNA-seq数据集。

作者指出，“TAS-Seq对末端转移酶反应的变化表现出很高的耐受性，这使得现有的基于末端转移酶的scRNA-seq方法的处理变得复杂。”

作者使用小鼠和人类的肺样本，比较了TAS-Seq和基于流式细胞术的scRNA-Seq数据，发现了良好的相关性。除了提高基因检测灵敏度外，研究人员还使用TAS-Seq检测到细胞间的强大相互作用以及细胞中更多生长因子和白细胞介素的表达，而广泛使用的现有scRNA-Seq技术（如10X Chromium v2和Smart-seq2），依赖于模板转换。作者发现，与其他scRNA-Seq平台相比，TAS-Seq不仅可以检测更多的基因，还可以识别出更多表现出高度可变表达的基因。

Shichino说：“我们发现TAS-Seq在基因检测灵敏度和基因丢失率方面可能优于10X Chromium V2和Smart-seq2，这表明TAS-Seq可能是最敏感的高通量scRNA方法之一。我们可以更均匀地检测各种表达水平的基因，也可以更稳健地检测生长因子和白细胞介素基因。”

根据他们在肺样本中的发现，作者指出，“扩大TAS-Seq应用将提高对单细胞水平肺生物学的理解和图谱构建。”

该论文的第一作者、东京理科大学助理教授Shigeyuki Shichino博士说：“我们的技术TAS-Seq结合了基因检测灵敏度、反应效率的稳健性和细胞成分的准确性，使我们能够捕获重要的细胞信息。”

与用于扩增DNA的聚合酶不同，末端转移酶不需要模板。然而，这很难处理。研究人员通过使用终止DNA扩增反应的ddNTP克服了这一挑战。

Shichino说：“ddNTP掺入，特别是双脱氧胞苷磷酸（ddCTP），以随机方式阻止了TdT对polyN-tail的过度延伸，大大降低了TdT反应的技术难度。”

通过使用基于纳米孔/磁珠的scRNA-seq平台分离单个细胞，新方法还降低了细胞采样偏差，并提高了细胞组成数据的准确性。

TAS-Seq的另一个优点是降低了对批次效应的敏感性。TAS-Seq数据也与组织样本的流式细胞术数据高度相关，表明它可以生成高度准确的细胞组成数据。

Shichino说：“我们已经完成了TAS-Seq2的开发，这是一种TAS Seq的改进版和全面优化版本，TAS-Seq2在小鼠脾细胞中的基因检测灵敏度提高了1.5到2倍。”东京理科大学的研究人员已经成立了一家创业公司（ImmunoGenetics），将使用这种新方法提供scRNA-seq服务。