Elisa检测知多少(Ⅰ)

实验原理

酶联免疫吸附测定（Enzyme Linked Immunosrbent Assay, 简称 ELISA），其基础原理是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。

结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上 。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。

方法种类

照不同的原理及操作，将ELISA大致分为四类：直接ELISA，间接ELISA，夹心ELISA和竞争抑制ELISA。

1. 直接 ELISA

直接ELISA是所有ELISA中步骤最简单的一种，方法为将抗原按一定的比例用包被缓冲液稀释好包被到固相载体上，包被完成后简单洗涤，再加入封闭液，封闭结束后再次洗涤除去多余封闭液，加入稀释好的特异性的酶标抗体，37℃温育1h或4℃温育过夜后，洗涤除去多余的抗体，加入底物显色并判读结果。最后显色的深浅与加入的酶标抗体量成正比。

2. 间接 ELISA

间接 ELISA 的步骤与直接 ELISA 步骤前面的部分基本一致，不同的是，间接 ELISA 中与包被好的抗原结合的不是酶标抗体，而是非酶标的（一抗），另外再引入经过酶标的二抗与一抗特异性结合。最后加入底物显色并判读结果。

3. 夹心 ELISA

3.1 直接夹心 ELISA

直接夹心ELISA又分为双抗体夹心ELISA和双抗原夹心ELISA。

双抗体夹心ELISA的方法是：将第一种抗体（捕获抗体）包被在固相载体上，封闭后加入待检抗原，温育后加入第二种抗体（检测抗体），捕获抗体和检测抗体可以是针对不同表位的两种单抗，也可以是针对同一抗原的一种单抗与一种多抗，但是检测抗体需要经过酶标。

双抗原夹心ELISA的原理和操作与双抗夹心基本相同，不同的是用于捕获和检测的是抗原，待检对象是抗体。

3.2 间接夹心 ELISA

间接夹心ELISA是基于两种不同种属来源的抗体的夹心ELISA，其原理是将一种种属来源的特异性抗体包被于固相载体上（作为捕获抗体），封闭，加入待检抗原，温育，洗涤后加入另一种种属来源的特异性抗体（非酶标，作为检测抗体），最后加入酶标二抗（特异性识别检测抗体），再加底物显色。

4. 竞争抑制 ELISA

竞争抑制ELISA又称封闭ELISA，其主要原理是用待检抗原或抗体去干扰已经预先设计好的体系，最终显色的结果与待检抗原或抗体的干扰程度成负相关。大致分为直接竞争抑制ELISA、间接竞争抑制ELISA、夹心竞争ELISA等特殊的ELISA方法。

4.1 直接竞争抑制ELISA

直接竞争抑制 ELISA 中，预先将抗原包被在固相载体上，并加入酶标的特异性抗体。实验时，加入待检抗原（或抗体），如果待检对象是抗原，则待检抗原就与预先包被在固相载体上的抗原竞争结构酶标抗体；如果待检测对象是抗体，则待检抗体就与系统中原有的酶标抗体竞争结合包被在固相载体上的抗原。洗涤过程就可以洗掉被竞争下的酶标抗体，最后加底物显色。最终显色的结果与待检原（或抗体）量成反比。

4.2 间接竞争抑制ELISA

间接竞争抑制ELISA中，将抗原包被于固相载体上，依次加入特异性的抗体以及此抗体对应的酶标二抗作为预制备的体系。实验时，加入稀释好的待检抗原（或抗体），待检标本中的抗原（或抗体）就和预制备体系中固相载体上结合的抗原（或抗体）竞争结合特异性的抗体（或固相载体上结合的抗原）。