- PMID: 31090900
- PMCID: PMC6637375
- DOI: 10.1093/annonc/mdz132
ANNALS OF ONCOLOGY IF: 32.976（2021年6月30日公布）
摘要
背景：全基因组测序（WGS）是揭示肿瘤体细胞突变负担多样性和复杂性的有力方法。在这里，我们调查了肿瘤和匹配的种系WGS对了解家族性乳腺癌高危人群的病因和治疗机会的效用。
患者和方法：我们对来自携带BRCA1（n=26）或BRCA2（n=22）致病性变体的个体或来自非携带者（非BRCA1/2；n=30）的78对生殖系和肿瘤DNA样本进行WGS。
结果：匹配的种系/肿瘤WGS和体细胞突变特征分析显示，患者癌症风险基因中存在未报告的双重致病性种系变体（BRCA1/BRCA2；BRCA1/MUTYH）。该策略确定，100%来自BRCA1携带者的肿瘤和91%来自BRCA2携带者的肿瘤表现出各自基因的双等位失活，以及提示同源重组功能缺陷的体细胞突变特征。一组非BRCA1/2肿瘤也具有表明BRCA缺乏的体细胞特征，包括BRCA1启动子甲基化的肿瘤，以及来自PALB2致病性种系变异体和意义不确定的BRCA2变异体携带者的肿瘤。13例早期发病的非BRCA1/2肿瘤患者BRCA-proficient，但显示出复杂的集群结构重排，与癌基因扩增和TP53、ATM和CHEK2致病生殖系变异相关。
结论：我们的研究强调了配对生殖细胞/肿瘤DNA的WGS和体细胞突变特征在发现致病生殖细胞变异中发挥的作用，并为变异致病性提供支持证据。 WGS推断的特征比种系状态和同源重组缺陷的其他基因组预测因子更可靠，从而影响基于铂或PARP抑制剂治疗的选择。在WGS首次对非BRCA1/2肿瘤进行的检查中，我们阐明了这些肿瘤基因组的相当大的异质性，并强调复杂的基因组重排可能会驱动一部分病例的肿瘤发生。
关键词：家族性乳腺癌，BRCA1，BRCA2，全基因组测序，突变特征
介绍
方法
我们分析了来自高危家族性 BC 患者的 78 例肿瘤，以研究 WGS 如何影响个人及其家庭的风险管理和治疗。病例是BRCA1致病性种系变异 ( n = 26)、BRCA2致病性种系变异 ( n = 22) 或两者都没有（非BRCA1/2，n = 30）的携带者（补充表 S1，可在Annals of Oncology获取在线的）。为了表征这些病例的体细胞景观，匹配的健康对照/肿瘤 DNA 使用 Illumina X-Ten 测序进行 WGS，平均折叠深度分别为 34 × 和 68 ×。分析 WGS 数据以表征体细胞突变 [单核苷酸变体 (SNV)、插入缺失、结构变体、拷贝数]、突变特征和 HR 缺陷测量 (HRDetect, HRD Index)（补充表 S2，可在Annals of肿瘤学在线）。这种方法突出了家族性 BC 的基因组不稳定性的重要机制。
有关详细信息，请参阅《肿瘤学年鉴》在线提供的补充材料。
(补充材料是一个压缩包：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6637375/bin/mdz132_supplementary_data.zip)
结果
BC家族的体细胞景观
BRCA1、BRCA2和非BRCA1/2携带者的肿瘤的体细胞突变情况不同（图 1; 补充图 S1，可在Annals of Oncology在线获取）。先前确定的 93 个 BC 驱动基因中的 79 个 [ 9 ] 在至少一个肿瘤中发生了突变；包括BRCA1肿瘤中TP53 (88%)和非BRCA1/2肿瘤中GATA3/PIK3CA (50%)的高频率突变（补充图 S2、表 S3 和 S4，可在Annals of Oncology在线获得）。与非BRCA1/2肿瘤相比， BRCA1和BRCA2肿瘤具有更多的小缺失和 SNV ；和与BRCA2和非BRCA1/2肿瘤相比， BRCA1肿瘤表现出更高数量的结构重排，包括重复和易位（ P ≤ 0.001，Mann-Whitney U检验）。
图1 由原始临床诊断确定的按 BRCA 状态分组的 78 种家族性乳腺癌的体细胞突变情况。(A) 每个样本的临床信息包括：来自BRCA1和BRCA2临床测试的种系致病变异状态雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体2（HER2）的基因、性别、诊断年龄、肿瘤形态类型、组织学分级和生物标志物状态。(B) 每个样本的体细胞插入缺失数。(C) 体细胞单核苷酸变体 (SNV) 的数量。(D) 体细胞结构重排的数量和类型。IC NST，无特殊类型的侵袭性癌；MDL，混合导管小叶癌；DCIS，原位导管癌；ILC，浸润性小叶癌；医学。Ca.，髓样癌；遇见。Ca.，化生性癌；粘液。Ca.，粘液性癌；＃， 数字; 不适用，不可用。
确定了五个替换和五个重排特征 [ 8 , 9 ]（图 2; 补充图 S3，可在Annals of Oncology在线获取）。BRCA1-肿瘤具有最高比例的替代特征3和重排特征3；而BRCA2-肿瘤的替代特征 8 和重排特征 5 的负担最高（P ≤ 0.001，Mann-Whitney U检验）。
图2 家族性乳腺癌的体细胞突变特征。(A) 确定了五个替代突变特征，并使用余弦相似性将特征与 COSMIC 中的已知特征进行比较（突变特征 v2 - 2015 年 3 月；基于最高相似性分配特征）。(B) 确定了五个体细胞重排特征，并使用余弦相似性与先前在乳腺癌中报道的重排特征进行比较。重排被分组为是否在基因组中聚集，然后按类型分组：缺失（Del）、重复（Dup）、倒位（Inv）或易位（T）；然后按大小（如x轴所示）。(C) 每个肿瘤存在的每个替代特征的比例（参见图例中的颜色编码）：肿瘤来自BRCA1携带者具有较高比例的替代特征 3（橙色）；BRCA2携带者的肿瘤具有更高比例的替代特征 8（紫色）；来自非BRCA1/2病例的肿瘤具有异质的特征模式，但替代特征 1 的比例很高（以前与年龄相关；绿色）。一个肿瘤具有显性特征 18（MUTYH，蓝色），一个肿瘤具有显着特征 13（APOBEC，红色）。(D) 每个肿瘤的每个重排特征的比例（参见图例中的颜色编码）：来自BRCA1携带者的肿瘤具有更高比例的重排特征 3（蓝色），来自BRCA2的肿瘤携带者有更高比例的重排签名5（浅蓝色）；来自非BRCA1/2病例的肿瘤具有异质的重排特征模式，但重排特征 4（绿色）和 2（紫色）的比例最高。
非BRCA1/2肿瘤的突变谱是多种多样的，表明可能存在异质病因。肿瘤具有：（i）具有很少体细胞突变的安静基因组，（ii）与 APOBEC 替代特征相关的高 SNV 负担 [ 8 ]，（iii）重排特征 4（聚集重排）的高负担，或（iv）突变特征提示BRCA1/2缺陷（图 1和和2；2; 补充图 S1-S3和表 S2，可在Annals of Oncology在线获取）。
体细胞突变特征对肿瘤进行分层
基于每个肿瘤中多个突变特征的贡献的无监督层次聚类将队列分为三组，广泛捕获种系状态，因此这些组被称为“BRCA1-like”、“ BRCA2-like”或“non-BRCA1/2-like'（图3）。十个肿瘤 (13%) 聚集远离其“原始 BRCA 状态”，包括两个BRCA1-、两个BRCA2-和六个非BRCA1/2-肿瘤。分层为“非BRCA1/2样”的所有肿瘤均具有 BRCA 能力（HRDetect 评分 <0.7），而所有“ BRCA1样”和“ BRCA2样”肿瘤均缺乏 BRCA（图 3; 补充图 S4和表 S2，可在Annals of Oncology在线获取）。我们表明，与单独使用单个突变特征相比 ，多个突变特征或 HRDetect [7] 的组合能够更好地分类肿瘤中的 HR 状态图3; 补充图 S4，可在Annals of Oncology在线获取）。
图3 使用体细胞突变特征的无监督层次聚类对肿瘤进行分层。(A) 体细胞基因组特征的层次聚类基于每个肿瘤的每个突变特征的百分比贡献（参见底部的颜色编码）、插入与缺失的比率以及使用欧几里得方法的 HRD 指数 [ 3 , 4 ]用于相异矩阵和 Ward.D2 用于层次聚类。主要根据 BRCA 状态（ BRCA1或BRCA2或非 BRCA1/2 的生殖系携带者）将肿瘤分为三组，因此这三组被称为“ BRCA1样”、“ BRCA2样”或“非BRCA1/ 2-喜欢'。(B) 每个肿瘤中的突变数量，包括插入和缺失、SNV 和结构重排，由与不同突变特征相关的突变数量着色。(C) 面板显示 HRDetect 评分 [ 7 ]（原始研究中 HR 缺陷的截止值 > 0.7；所有BRCA1和BRCA2样肿瘤的评分 > 0.99）和致病性种系变异和/或在BRCA1或BRCA2中观察到的体细胞改变。(D) 临床资料及肿瘤特征如图 1，以及文本中讨论的病例的肿瘤代码。(E) 每个子组的圆环图示例，显示结构重排的特征模式。从左起：FBC050727（非BRCA1/2）、FBC070474（聚集重排）、FBC061542（BRCA2双等位基因失活）、FBC020031（PALB2 双等位基因失活）、FBC060031（BRCA1双等位基因失活）、FBC060116（BRCA1启动子甲基化/LOH）。VUS，临床意义未知的变体；LOH，杂合性丢失；不适用，不可用。
具有“BRCA1样”突变signatures的肿瘤的WGS特征
29 个肿瘤显示“BRCA1样”突变特征；根据 HRDetect，所有人都具有BRCA1的双等位基因失活并且是 BRCA 缺陷的。大多数肿瘤为 3 级和三阴性，但包括 2 个组织学 2 级、4 个 ER/PR 阳性和 3 个 HER2 阳性肿瘤（图 3）。
WGS 衍生的突变特征发现了以前未检测到的双种系致病变异携带者。病例 FBC090235 携带通过种系检测鉴定的BRCA2种系致病变异（c.574_575delAT；p.Met192ValfsX13）。WGS 不仅揭示了BRCA2的单等位基因缺失，而且还揭示了BRCA1种系结构重排（chr17：g.41230286_41236428dup）以及野生型等位基因的体细胞缺失（图 3; 补充图 S5，可在Annals of Oncology在线获取）。病例 FBC070205 携带BRCA1种系致病变异 (c.5244_5245delAA; p.Lys1748fs) 和野生型等位基因的体细胞丢失，肿瘤显示出体细胞重排特征 3 的高贡献。
然而，替代特征由NPCPA或NPCPT上下文中的 C>A 颠换为主导（图2和图3），这与BER基因MUTYH[11]的失活有关。我们随后鉴定了MUTYH种系致病性变异（c.1556G>A；p.Arg519Gln）和野生型等位基因的体细胞丢失（补充图 S6，可在Annals of Oncology在线获取）。两个基因的双等位基因失活，连同它们的突变特征的证据表明，这两个基因都促成了肿瘤发生。
四个非BRCA1/2肿瘤具有提示BRCA1功能丧失的突变特征（病例 FBC020021、FBC040626、FBC060116、FBC050467）（图3）。每个肿瘤都有BRCA1的体细胞 LOH，三个表现出体细胞BRCA1启动子甲基化（病例 FBC050467 的肿瘤 DNA 不足以进行甲基化评估）。在所有四个病例和其他家庭成员的血液中检测了BRCA1启动子甲基化，但都发现未甲基化，这表明这些肿瘤可能是由BRCA1的体细胞双等位基因失活驱动的（补充图 S7，可在Annals of Oncology在线获取）。我们没有发现参与 HR 通路 [ 12 ] 的 52 个额外基因的双等位基因失活的证据，这可以解释 HR 缺陷特征（补充表 S3-S6，可在在线肿瘤学年鉴中获得）。
具有“BRCA2样”突变特征的肿瘤的WGS特征
根据 HRDetect，24 个肿瘤含有“BRCA2样”特征，所有肿瘤都缺乏BRCA1/2 。该组包括 22个BRCA2肿瘤中的 20 个，每个都具有BRCA2的双等位基因失活；19 例 ER/PR 阳性肿瘤、9 例 2 级肿瘤和 2 例浸润性小叶癌（图 3）。
非BRCA1/2病例 FBC020031 的 WGS 证实了先前鉴定的PALB2无义变体（rs180177132；c.3113G>A p.Trp1038*）并检测到野生型等位基因的体细胞丢失。肿瘤是“ BRCA2样”，具有高负荷的替代特征 3 和重排特征 5，支持先前的研究，将 PALB2 功能丧失与 BRCA 缺陷特征联系起来 [ 7 , 10 , 13 ]。
非BRCA1/2病例 FBC060681 带有BRCA2 VUS (c.7828G>A p.Val2610Met)。肿瘤呈现出野生型等位基因的体细胞缺失，以及“BRCA2样”突变特征。该变体未在 gnomAD 或 560 BC 基因组队列 [ 9 ] 中报告，并被 ClinVar（变体 ID：135816）描述为“3 级不确定意义”（补充表 S5，可在Annals of Oncology在线获取）。该变体位于高度保守的氨基酸中，预计会在外显子 17 中产生从头供体剪接位点，尽管没有实验证据支持这一点 [ 14]。该变体的蛋白质模型预测了对蛋白质结构和功能的破坏性影响（补充图 S8，可在Annals of Oncology在线获取）。在这种情况下，没有发现 52 个 HR 相关基因 [12 ] 双等位基因失活的证据（补充表 S3-S6，可在Annals of Oncology在线获取）。
具有“非BRCA1/2样”突变特征的肿瘤的WGS特征
25 个肿瘤被归类为“非BRCA1/2样”，包括来自非BRCA1/2病例的 24 个肿瘤和一个缺乏BRCA2体细胞失活的BRCA2肿瘤（FBC016006、NM_000059.3、c.1310_1313delAAGA）野生型等位基因（补充图 S9，可在Annals of Oncology在线获取）。22 个肿瘤为 ER/PR 阳性；6人是HER2阳性；并且所有人都被认为精通 BRCA（图 3）。病例 FBC070169 具有很强的 APOBEC 替代特征，占体细胞突变的 94%，但没有证据表明先前与该特征相关的APOBEC3A或*APOBEC3B种系变体 [ *15 , 16 ]。
基于重排特征 1、2 和 4 的贡献， 无监督层次聚类将“非BRCA1/2样”肿瘤分为两组（图3和和4；4; 补充图 S10，可在Annals of Oncology在线获取）。12 个肿瘤具有由重排特征 2（ n = 9；具有 1q 的复发性增益和/或 16q 的丢失）或重排特征 1（n = 3）主导的相对安静的基因组。其余 13 个肿瘤在诊断时较年轻（中位年龄 44 岁对 62 岁），并显示出重排特征 4 的高贡献，涉及聚集到一个或几个染色体的复杂重排。这些聚集事件与已知 BC 癌基因（例如ZNF217、ERBB2、CCND1、MYC）的扩增相吻合[ 9]，并且在 8/13 的肿瘤中，重排模式提示了断裂-融合-桥 (BFB) 循环的证据；另外两个肿瘤发生了类似于染色体碎裂和 BFB 的事件（图 4）。我们观察到“非BRCA1/2样”肿瘤的端粒比BRCA缺陷肿瘤短（补充图 S11，可在Annals of Oncology在线获取）提高了由于端粒侵蚀导致双着丝粒染色体形成可能导致 BFB 和/或 chromothripsis [ 17 , 18 ]。我们无法识别候选基因中与染色体分离或端粒维持相关的种系或体细胞变异，这些变异可能导致这种重排模式。然而，在四种情况下，我们在TP53 ( NM_000546.5 : c.1009C>T)、ATM (NM_000051.3 : c.4909+1G>A) 和CHEK2 ( NM_007194.3 : c.349A>G; NM_007194.3 : c.1100delC)，连同野生型等位基因的体细胞损失，暗示相关蛋白（图 4）。
图4 非BRCA1/2样肿瘤的全基因组 DNA 拷贝数谱。(A)根据重排特征 1、2 和 4 分层的非BRCA1/2样肿瘤基因组中的染色体臂水平拷贝数数据 [增益（红色）和损失（蓝色）]。肿瘤绘制在同一顺序如图3。鉴定出以下肿瘤：在风险基因ATM、TP53或CHEK2中含有种系致病变异；显示Break-Fusion-Bridge和/或chromothripsis的证据；并拥有各种癌基因的扩增。(B)组织学分级分布无显着差异(χ2 )。(C)与具有其他基因组特征的非BRCA1/2肿瘤相比，具有高比例重排特征 4（聚集重排）的非BRCA1/2样肿瘤在显着年轻时被诊断出来（Mann-Whitney U 检验，两个-尾）。(D) 显示ATM、TP53和CHEK2中具有种系变异的病例的 Circos 图。
讨论
这项研究代表了 WGS 检查的最大的家族性 BC 病例队列，也是来自高风险、非BRCA1/2家族的第一份报告。研究结果表明，结合种系和体细胞 WGS 可以作为伴随诊断在阐明个体癌症风险和帮助治疗决策方面提供影响。我们证实了种系风险基因双等位基因失活对驱动体细胞突变特征特定模式积累的重要性。BRCA1、BRCA2和PALB2的功能丧失会产生高突变负担和推断 HR 缺陷的特定特征 [ 7 , 9 , 10 , 13 ]。尽管角色TP53、ATM和CHEK2在 DNA 损伤信号传导和双链断裂检测中，这些肿瘤不显示 BRCA 缺陷特征的证据，如前所述 [ 9 , 13 , 19 ]，但它们具有高度复杂的成簇染色体重排。
WGS 衍生的签名将两个人确定为双种系致病变异（BRCA1/BRCA2和BRCA1/MUTYH）的携带者，这在以前没有报道过。突变特征表明BRCA1而不是BRCA2的双等位基因失活在BRCA1/BRCA2病例中驱动肿瘤发生。临床BRCA1和BRCA2检测（2004 年）确定了致病性BRCA2种系变异（c.574_575delAT；Met192ValfsX13），因此未进行进一步检测。在这项研究中，发现一名被诊断患有 BC 的家庭成员没有携带这种变异，更广泛的测试显示BRCA1种系重排。在考虑BRCA1重排之前， BRCA1/BRCA2家族中的疾病分离是不完整的。BRCA1和BRCA2中同时发生的种系致病变异是罕见的（0.3%，93/32,295 例），携带者比仅携带BRCA1或BRCA2的携带者更有可能被诊断为 BC [ 20 ]。关于BRCA1 / MUTYH的发病率和风险状况知之甚少携带者和其他家庭成员的生物样本无法获得，因此尚不清楚这些变异是如何与疾病分离的。然而，很明显这两个基因的双等位基因失活有助于肿瘤发生。这些案例证明了彻底的种系测试的重要性以及 WGS 作为单一测试的力量，以 (i) 筛选不同类型变体（SNV 和重排）的整个基因；(ii) 为变异发现和描述疾病病因学得出体细胞突变特征。
有几条证据支持BRCA2 VUS (c.7828G>A p.Val2610Met) 有助于肿瘤发生：(i) BRCA2的体细胞双等位基因失活（VUS 和 LOH）；(ii) 根据突变特征的模式，肿瘤是“BRCA2样”，并且根据 HRDetect 是 BRCA 缺陷的；(iii) 在其他 HR 通路基因中没有发现可以解释这种 BRCA 缺陷的变异；(iv) 蛋白质模型预测了对蛋白质功能的负面影响。这种罕见的变异只在文献 [ 14 ] 中描述过一次，评估与此处报道的同一个人。有必要进一步研究这种罕见的 p.Val2610Met 变体的致病性。
大多数家族性 BC 属于非BRCA1/2的总称，涉及其他中度至高度外显基因的种系变异，或者潜在的遗传原因未知。非BRCA1/2肿瘤表现出相当大的形态 [ 21 ]、分子 [ 22 ] 和基因组异质性。WGS 在许多情况下提供了有关肿瘤发生驱动因素的证据，包括BRCA2 (VUS)、PALB2、CHEK2、ATM和TP53 变体的种系携带者；BRCA1启动子甲基化、APOBEC 诱变和癌基因扩增。
具有复杂的成簇结构重排模式的“非BRCA1/2样”肿瘤亚组是具有 ER 阳性和/或 HER2 阳性表型的早发性癌症。复杂的重排与各种癌基因的扩增有关，并显示出 BFB 和 chromothripsis 作为驱动肿瘤发生的潜在机制的证据 [ 18 ]。该组中有 4 例在ATM [ 23 ]、CHEK2 [ 24 ] 或TP53 [ 25 ] 中存在种系致病变异，均具有体细胞 LOH。Chromothripsis 和 BFB 在许多肿瘤类型中都有报道，有趣的是，ATM和TP53与急性淋巴细胞白血病 [ 26 ] 和髓母细胞瘤 [ 27 ] 中这种复杂的结构重排有关。虽然这些重排模式已在 BC [ 28 , 29 ] 中报道，但它们与种系易感性无关。有趣的是，在种系TP53携带者中，>60% 的 BC是ERBB2 / HER2扩增的 [ 30 ]，并且暗示复杂的结构重排来驱动此类癌症的扩增 [ 29 ]。
更好地预测对治疗的反应对于推进肿瘤学至关重要。研究人员使用了各种方法来提高 DNA 损伤性化学疗法和 PARPi 的效用，例如：BRCA1或BRCA2的种系状态；这些基因的体细胞LOH；三阴性肿瘤表型；或体细胞突变模式 [ 2-7 ]。我们证实了 WGS 和 HRDetect [ 7 ] 的效用，以增强肿瘤的分层，与个体基因组参数（例如 HRD 评分和替代特征 3）相比，BRCA 熟练与缺乏。使用这种方法，所有BRCA1肿瘤、91% 的BRCA2肿瘤和PALB2肿瘤具有所述基因的双等位基因失活和HR缺陷的有力证据。预计这些病例是铂类化疗或 PARPi 的良好候选者，其中包括 12 个不属于该治疗建议的肿瘤（即组织学 2 级、ER/PR 阳性 [ 31 ] 或侵袭性小叶癌）。与最近的一份报告相反，只有两个来自BRCA2携带者的肿瘤（2/22, 9% vs 46% [ 5 ]）没有表现出基因的双等位基因失活。由于BRCA1的双等位基因失活，一个肿瘤是 BRCA 缺陷的，而另一个是BRCA-proficient的，因此后一个患者不太可能从这种治疗中受益。
总之，匹配的种系/肿瘤 WGS 可以改善对疾病潜在遗传原因的识别，而不是单独进行BRCA1和BRCA2种系筛查，这可能会改善个人及其家庭的临床管理。此外，WGS 对 BRCA 缺乏产生了最有力的评估，还可以识别 BRCA 熟练肿瘤中的致癌驱动因素，这共同可能会增强对患者靶向治疗的选择。
补充材料
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6637375/bin/mdz132_supplementary_data.zip