维生素B5和琥珀酰辅酶A可以改善SF3B1基因突变引起无效造血过程

今天给同学们分享一篇实验文章“Vitamin B5 and succinyl-CoA improve ineffective erythropoiesis in SF3B1-mutated myelodysplasia”，这篇文章发表在Sci Transl Med期刊上，影响因子为17.1。

结果解读：

SF3B1突变导致MDS-RS患者COASY异构体的错误剪接

MDS造血细胞在骨髓和血液中的缺氧和正常氧环境下都会发展。为了捕捉SF3B1突变对这两种环境的影响，作者在正常氧和缺氧条件下进行了实验。本研究使用了42例MDS患者（15例SF3B1野生型[WT]；27例SF3B1突变型）（表S1）。从3例MDS患者（SF3B1 mut -H662Q/H662Q/K700E）和3名年龄相配的健康供体（HDs）的骨髓细胞中，分别在正常氧（20% O 2 ）和缺氧（3% O 2 ）条件下进行了集落形成实验（30, 31）（图1B-E）。然后，作者使用150 bp配对末端测序对HSPC衍生的集落进行了RNA测序，平均每个样本读数为1.38亿（图S1A）。使用rMATS（32）进行差异剪接分析，发现了3,864个在三个MDS-RS样本中共同发生的错误剪接事件，虚假发现率（FDR）<0.05。作者观察到在正常氧和缺氧条件下，SF3B1 mut 细胞中A3SS事件增加（图2A），与先前的研究一致（22）。未监督的错剪事件聚类导致SF3B1 mut 样本与具有野生型SF3B1的HD样本的聚类有明显区别（图2B-C）（GEO存取号：GSE173108）。根据错剪程度对转录本进行异常剪接并排名的火山图显示，在缺氧和低氧条件下分别调控了1665个和2199个事件（显著事件以红色表示，P <0.05；包含水平 >|0.2|）（图2D）。对在缺氧和低氧条件下与健康供体相比在MDS-RS样本中富集的错剪基因进行基因本体路径分析，发现受影响的关键细胞途径包括SF3B1 mut 患者的翻译和mRNA处理（图2E）。在2,845个错剪基因中，有200个在SF3B1 mut 样本的缺氧和低氧条件下共享（图2F和数据文件S1&S2）。差异基因表达的GSEA分析指出血红素代谢减弱以及三羧酸循环（TCA循环）活性降低（图2G）。因此，作者的分析重点放在可能影响这两个途径的剪接事件上，并导致了辅酶A（CoA）合酶（COASY）基因的剪接错误的鉴定（图3A-C，S1B-F）。COASY催化CoA的生物合成的最后步骤，CoA是所有细胞酶的4％的辅因子（33）。CoA对于乙酰辅酶A进入三羧酸循环的碳输入和丙酰辅酶A的生成是必需的，丙酰辅酶A是δ-氨基酮戊二酸（ALA）合酶（ALAS2）的重要底物，ALAS2是血红素生物合成的速率限制酶（图S2A）。COASY的生殖细胞突变先前已与常染色体隐性遗传疾病（神经退行性脑铁沉积症，NBIA）（34-36）和脑桥小脑发育不良（37）相关。NBIA类似于MDS红细胞生成缺陷的一些临床表现，包括铁平衡和血红素生物合成缺陷。因此，作者决定调查COASY剪接错误是否会导致蛋白质丧失，最终导致CoA的耗尽和丙酰辅酶A丰度的降低，从而为MDS SF3B1 mut 患者的无效红细胞生成做出贡献。

COASY转录错误拼接导致SF3B1 mut 细胞中的蛋白质丢失和辅酶A合成缺陷

COASY错配发生在5'UTR内，并被归类为一种选择性3'剪接位点（A3SS），其包含水平为38.7%。这种错配事件与替代转录本的切换相关，其中转录本NM_001042532.4（COASY beta）和XM_011525300.2成为MDS SF3B1突变患者中的主要亚型，而经典的NM_001042523.9亚型编码COASYα（图3B）。对25个患者样本（3个HDs，5个MDS SF3B1 WT和17个MDS SF3B1突变）进行的RT-qPCR实验证明，beta亚型仅在突变的SF3B1患者中出现（图3C）。这些结果在一个独立的验证队列中得到了证实（10个MDS SF3B1 WT和8个MDS SF3B1突变）（图S1E）。RT-qPCR也观察到了XM COASY亚型的显著变化（p<0.01），而COASY的alpha亚型保持不变（图3B和图S1F）。

使用CRISPR/Cas9系统，作者将最常见的SF3B1杂合突变（K700E）引入到K562细胞系中（图4A）。这导致COASY的5'UTR错误剪接，完全复制了MDS-RS患者观察到的剪接模式，并重现了先前报道的其他错误剪接事件（图4B和图S2B-C）。这种异构体转换导致COASY蛋白表达减少约60%（图4C-D）。这一发现在HNT-34（一种CMML/AML患者来源的细胞系）中得到了证实，该细胞系携带SF3B1突变（图4E和图S2D）。在表达SF3B1的K562细胞中，通过doxycycline诱导启动子控制（38），观察到了相同的结果（图S）。值得注意的是，对来自一个健康供体、四个SF3B1 WT和三个SF3B1突变MDS-RS患者样本的原始CD34细胞进行的Western blot分析证实了SF3B1突变样本中COASY表达的丧失（图S2F）。

COASY缺陷影响人类原代细胞中的红细胞分化

为了调查COASY的丧失是否会导致琥珀酰辅酶A的耗竭从而影响红细胞生成，作者使用慢病毒方法在CD34 + HSPCs中沉默了COASY（图5A和图S3C-D）。直接沉默COASY导致CoA显著耗竭（p<0.0001）（图S3E），这与作者的SF3B1突变模型得到的数据一致（图S3F）。在COASY沉默后，CD34 + HSPCs的克隆能力显著降低（p<0.005），对爆发性红细胞单位（BFU-E）活性产生了重大影响（图5B-D和图S4A-D）。这些结果促使作者分析COASY基因在最不成熟的造血细胞组分（图S5A-B）和红细胞分化过程中（图5E-L）的表达。值得注意的是，COASY在第7天显示出表达高峰（图5G），这在另一项研究中观察到的血红素产生高峰之前（41天）。

维生素B5和琥珀酰辅酶A可以纠正在MDS-RS SF3B1中观察到的红细胞分化缺陷

鉴于COASY在红细胞生成过程中的关键作用，作者评估了COASY/辅酶A/琥珀酰辅酶轴在原发性骨髓增生异常综合征红细胞生成不良患者中的靶向治疗潜力。基于患者SF3B1 mut 细胞仍然会表达40%的COASY酶的理论，作者在红细胞分化模型中处理了原发性CD34 + 患者细胞（来自MDS-RS患者或健康供体），使用上游底物COASY、维生素B5或其下游产物琥珀酰辅酶（图6A）。与先前的报告一致，（41）经过促红细胞生成素处理的MDS-RS细胞在14天后停滞于分化阶段，并积聚在CD71 - CD235a - 和CD71 + CD235a - 亚群中，只有少数细胞成熟为CD71 - CD235a + 细胞（图6B）。维生素B5处理MDS-RS细胞显著增加了CD71 + CD235a + 和CD71 - CD235a + 的成熟程度（p<0.05），而琥珀酰辅酶处理则在MDS-RS患者中促进了红细胞前体细胞的成熟和血红素产生（图6C-D和图S6A-E）。需要注意的是，在对任何一种底物进行处理后，健康供体骨髓间充质干细胞（BM HSPCs）的不同红细胞群体没有观察到任何变化。为了证明琥珀酰辅酶A（succinyl-CoA）而不是琥珀酸成分能够拯救红细胞系谱分化，作者对沉默了COASY基因的脐带血（UCB）HSPCs细胞进行了琥珀酰辅酶A、琥珀酸或载体的处理。值得注意的是，只有琥珀酰辅酶A能够拯救COASY基因沉默的红细胞的表型和形态分化（图S6F-G）。总的来说，作者的结果表明，维生素B5和琥珀酰辅酶A可以克服MDS-RS患者红细胞阻塞，并通过刺激红细胞祖细胞中的血红素产生来增加红细胞的成熟（图S7）。

总结

总的来说，作者的研究结果可能为预防MDS-RS患者的铁积累开辟治疗途径。值得注意的是，通过RT-qPCR检测COASY的可变剪接形式可以成为MDS-RS疑似病例的诊断测试的基础。此外，COASY/CoA/琥珀酰辅酶轴代表了一个潜在的治疗靶点，对于治疗MDS-RS患者的无效红细胞生成具有高度相关性。尽管琥珀酰辅酶需要进一步的药代动力学/吸收分析来确定安全性，但可行性研究已经表明，泛酸/维生素B5在口服给药时是安全且耐受良好的（56）。因此，维生素B5代表了一个有吸引力的药物，可以与现有治疗方案结合，以增加MDS-RS患者的红细胞成熟度并延迟对红细胞输血的依赖性。