如何提取高纯度的去内毒素的小量质粒 DNA？

操作步骤： (请自备 1.5mL 离心管、异丙醇、无水乙醇）

1. 取出洗涤液 A 和洗涤液 B，按 70%比例加入无水乙醇，如每 3mL 洗涤液 A 和洗涤液 B 各加入 7mL 无水乙醇，混匀。

2. 取 1.5mL 菌液，置于 1.5mL 离心管中，4000rpm 4℃离心 3min，彻底弃除上清。

3. 加入 0.5mL 溶液 A，充分振荡 2min，使菌体充分悬浮，确保无絮块存在。4000rpm、4℃离心 3min，彻底弃除上清。

4. 加入 200uL 溶液 I 和 5uL 溶液 B，充分振荡 2min，使菌体充分悬浮，确保无絮块存在。

5. 加入 400uL 溶液 II，盖紧管盖，轻轻颠倒混匀 6 次，注意整个管子的内表面均需与溶液 II 接触，室温放置至溶液清亮。（若 5min 后溶液未变清亮，说明菌体过多，应减少菌量。注意混匀手法要温和，切勿剧烈混合。）

6. 加入 300uL 溶液 III，盖紧管盖，立即轻轻颠倒混匀 8 次，4℃放置 5min。（此步注意要尽快混匀，但手法要温和）

7. 12000rpm 4℃离心 10min，小心吸出上清，轻移至新的 1.5mL 离心管。（应在离心机自动停转后取出离心管，以免沉淀悬浮）

8. 加入 300uL 异丙醇，充分混匀。将吸附柱放入收集管内，将上述溶液 600ul 转入吸附柱内，静置 1min，12,000 rpm 离心 1min，弃收集管内废液，再将剩余溶液全部转移至吸附柱内，同上操作。

9. 将吸附柱放回收集管内，加 500μL 洗涤液 A 至吸附柱内，静置 2min，12,000 rpm 离心 1min，弃收集管内废液。

10. 将吸附柱放回收集管内，加 500μL 洗涤液 B 至吸附柱内，12,000 rpm 离心 1min，弃收集管内废液。

11. 将吸附柱放回收集管内，加 500μL 无水乙醇至吸附柱内，静置 2min ，12,000 rpm 离心 1min，弃收集管内废液。同时，按每份样本 40 μL取洗脱液，放置于 1.5mL 灭菌离心管中，65℃预热（如提取 10 份菌液，即取 4000 μL 洗脱液预热）。

12. 将吸附柱放回收集管内，12,000 rpm 离心 2min，离去残留的洗涤液。开盖，室温放置 3 分钟。

13. 取出吸附柱，放入新的 1.5 mL 离心管内，向吸附柱膜中间加入 40 μL 预热洗脱液，静置 1min，12,000 rpm 离心 2min，收集 DNA 溶液。

注意事项：

1、 溶液 II、溶液 III 如出现结晶或者沉淀，可在 37℃水浴中加热几分钟溶解，直至液体恢复澄清。

2、  提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。 如所提质粒为低拷贝质粒或者大于 10kb 的大质粒，可适当加大菌体使用量，同时按比例增加溶液 I、溶液 B、溶液 II、溶液 III 的用量。

3、  溶液 II 含碱性物质，洗涤液 A 含去内毒素清除因子，取液完成后应立即旋紧管盖，密封保存。