2021-12-25

Nature | 单细胞分辨率下恶性克隆适应性的非遗传决定因素

原创 骄阳似我 图灵基因 2021-12-25 21:26

收录于话题#前沿生物大数据分析

撰文：骄阳似我

IF：49.962

推荐度：⭐⭐⭐⭐⭐

亮点：

1．本文使用单细胞谱和谱系追踪（SPLINTR）追踪三种临床相关的急性髓系白血病小鼠模型中的等位基因克隆。发现恶性克隆优势是一种细胞固有的遗传特性，通过抑制抗原呈递和增加分泌性白细胞肽酶抑制剂基因（Slpi）的表达来促进，从遗传学上证实Slpi是急性髓系白血病的调节因子。

2．转录异质性的增加是一个特征，使克隆适合于不同的组织和免疫微环境，并在遗传上不同的克隆之间进行克隆竞争。与造血干细胞类似，白血病干细胞（LSC）显示出可遗传的克隆固有特性，即高克隆输出和低克隆输出，这有助于整个肿瘤质量。本文证明，LSC克隆输出决定了对化疗的敏感性，尽管高输出和低输出克隆对治疗压力的适应不同，但它们在LSC程序表达增加的情况下协调地从最小残留疾病中出现。

3．总之，这些数据为支持恶性克隆适合性的非基因转录过程提供了基本的见解，并可能为未来的治疗策略提供信息。

发育背景下的谱系追踪研究表明，存在细胞固有的遗传特性，指导细胞命运潜能和克隆动态。然而，关于非遗传多样性如何决定恶性环境中克隆行为的时间分析仍有待建立。急性白血病是由涉及混合系白血病（KMT2A，也称为MLL1）基因易位的致癌融合引起的，它在人类癌症中提供了一个罕见的例子，即单一的基因异常既有必要也足以导致侵袭性的、通常是致命的恶性肿瘤。这些突变惰性和遗传稳定性的癌症提供了理想的模型系统来研究非遗传过程导致克隆优势的原理。

近期，在Nature杂志上都发表了一篇名为“Non-genetic determinants of malignant clonal fitness at single-cell resolution”的文章，文章中开发了一种称为SPLINTR的表达条形码策略。而且为了能够同时和/或连续跟踪多个细胞群，构建了三个高度多样性的库，每个库都具有不同的条形码结构，并与不同的荧光色素相耦合。SPLINTR条形码可以使用3′单细胞RNA测序（scRNA seq）方法轻松捕获，无需额外的PCR富集，并且可以与匹配的DNA条形码测序相当的频率进行识别。由于条形码主要以单个细胞拷贝的形式存在，因此它们能够以时间分辨的方式准确描述克隆命运和基因表达。

为了了解不同的二级突变如何影响克隆适合度，从野生型或同基因C57BL/6小鼠中产生了三种遗传上不同的MLL-AF9白血病，其中在Flt3（Flt3ITD）或Kras（KrasG12D）中存在内源性敲入激活突变。外显子组和低覆盖率全基因组测序显示可忽略的遗传异质性，从患病小鼠收集的白血病细胞中没有结构重排和其他急性髓系白血病（AML）驱动突变。为了检测这些不同AML基因型的特性，用独特的SPLINTR条形码库对每一株系进行条形码编码，并分别移植到小鼠体内。每种基因型都证明了每只小鼠体内克隆组成、克隆大小和组织偏好的一致性。数据表明，无论致癌基因型如何，克隆优势是疾病起始克隆的细胞固有特性。为了了解这种固有的克隆适应性，在移植前立即评估了致病克隆祖先的转录组。尽管白血病起始克隆聚集在一起，表明其转录状态具有共性，但来自每个基因型的致病克隆也不共享同一基因表达模式。然而，最显著的共同点是Slpi在白血病起始克隆的祖先中的高表达，特别是在MLL-AF9+KrasG12D组中。

人类癌症很少由同基因克隆介导。因此在遗传多样性克隆之间的克隆竞争的背景下研究这些克隆优势原则。为了实现这一点，将混合基因型MLL-AF9细胞以相等的比例（以下简称竞争1:1:1）或倾斜的比例（以下简称竞争80:15:5；80%MLL-AF9；15%MLL-AF9+Flt3ITD；5%MLL-AF9+KrasG12D）移植到小鼠，这更准确地反映了临床上发现的恶性亚克隆结构。虽然单个基因型在小鼠中显示出可重复的克隆优势模式，但两个竞争组小鼠在克隆生长方面表现出更大的差异。虽然同基因MLL-AF9+KrasG12D白血病中的几个显性克隆也是在竞争环境中引发的疾病，但现在发现了几个竞争特异性MLL-AF9+KrasG12D克隆，它们仅在遗传上不同的克隆之间竞争的情况下显示出适合性。竞争特异性和等基因致病性克隆广泛聚集在一个相似的位置，但竞争特异性克隆显示出更大的转录异质性，这一特征与环境压力环境下的适应潜力相关。总之，结果表明克隆优势受遗传多样性克隆之间竞争的影响，在这种情况下，转录异质性可能促进恶性克隆适合性。图1 |克隆优势是细胞固有的。

为了研究不同的免疫和组织微环境对克隆优势的作用，将一组相同的SPLINTR条形码白血病细胞移植到一组免疫缺陷（NSG）小鼠或免疫活性（Ptprca）小鼠中。注意到白血病起始克隆在转录聚集在一起的所有微环境中共享，并显示了显性克隆的特征，包括丰富的LSC程序和Slpi的过度表达。这些转录因子均二聚或异源二聚，作为髓系细胞的主要调节因子发挥作用，尽管表达了多个家族成员（Cebpa/b/d/e），但只有Cebpe在白血病起始克隆占据的区域表现出差异表达。值得注意的是，在不同微环境的优势克隆中，Cebpe表达的增加经常与Slpi表达重叠。在以前的LSC遗传筛查中未发现Slpi，同样也未发现对Slpi敲除LSC体外生长和生存能力有明显影响。然而，当研究Slpi在体内的重要性时，观察到明显的证据表明，Slpi的降低显著损害克隆适应性。与这些数据一致，SLPI在伴有MLL融合和急性早幼粒细胞白血病（PML-RARA）的AML患者中表达最高，未经治疗的AML亚型具有最具侵袭性的自然史。图2 | Slpi调节体内恶性克隆优势。

所有的体内实验都确定了在癌症起始克隆中富集的预先存在的细胞固有转录状态。为了测试这些转录状态是否是可遗传的，从患病小鼠的骨髓和脾脏中分离出SPLINTR GFP标记的MLL-AF9+KrasG12D细胞，并用独特的SPLINTR文库对这些细胞重新编码，从而使这些白血病起始克隆具有GFP和mCherry（来源于骨髓）或GFP和BFP（来源于脾脏）条形码的独特组合。重新编码的细胞按相同比例混合并移植到受体NSG或Ptprca小鼠体内。尽管供体白血病的GFP条形码在受体中的分布保持不变，但只有骨髓或脾脏来源的克隆的一部分能够在受体中重现该疾病，表明除了克隆间的异质性外，克隆内的转录差异（克隆内异质性）也决定了恶性适合性，并且并非所有的同基因克隆兄弟姐妹都能使疾病永久化。这些发现提供了一些最有力的证据，排除了观察到的克隆优势的潜在隐性遗传驱动因素。有趣的是，来自骨髓的克隆构成了大多数疾病负担，髓外克隆的疾病起始能力明显受损。这些有趣的发现意味着癌症起始细胞的固有转录/表观遗传学特征在癌症起源细胞的自然微环境中保存得最好。为了确定LSC各代间遗传传递的共同转录特征，列举了每个细胞中存在的特定条形码对，并检查了次要受体骨髓或脾脏中主要-次要条形码对的基因表达和聚类模式，这些条形码对包括显性克隆（>2%的总疾病负担）。此外，当跨多代追溯这些疾病起始克隆的转录状态时，发现它们聚集在转录组空间的一个区域，其特征是Slpi、Cebpe和LSC基因签名的高表达和B2m的低表达。总之，这些数据为克隆适应特性的非遗传遗传提供了令人信服的证据，尽管在体外和体内暴露于不同的微环境中，一些细胞仍能稳定地遗传癌症发生和生长所需的转录状态。图3|定义克隆优势的转录程序的非遗传遗传。

与HSCs中的最新证据类似，LSC克隆也可分为高、中或低输出，并且这种细胞内在行为在不同受体小鼠中高度一致。为了了解这种细胞固有特性是否可遗传和/或受不同微环境的影响，使用顺序组合SPLINTR条形码策略在连续移植试验中跟踪克隆行为。接下来，我们研究了LSC固有克隆输出是否能预测对治疗的敏感性。尽管不能根除LSC被认为是复发的主要原因，但在克隆水平上，很少有分子洞察表现为最小残留病（MRD）的治疗逃避过程。为了解决这个问题，对患病小鼠进行了强化化疗（类似于人类AML治疗），并收集了一系列MRD样本，以详细分析相同克隆群体在有和无治疗压力的情况下的行为。数据表明，化疗耐药MRD克隆在治疗早期采用了不同的转录状态，与AML的衰老和其他休眠状态相关的转录特征显著丰富。值得注意的是，SPLINTR还能够揭示LSC固有克隆输出如何影响适应性反应。总的来说，共三种主要模式：（1）高/中产量克隆，其中克隆产量仅因治疗而短暂减少；（2）改变克隆行为以采用低输出状态的高/中输出克隆；（3）只有在治疗过程中，低输出克隆才会转变为高输出状态，从而导致治疗后绝大多数MRD负担。有趣的是，高/中输出和低输出化疗耐药克隆中的适应性转录程序有很大的不同，只有高/中输出克隆在治疗激发后主动采用暂时休眠状态。尽管适应的转录途径不同，但高/中和低输出克隆都汇聚到与LSC潜能相关的协调上调基因，这与几个组的功能数据一致。图4 |治疗压力下的克隆动力学。

肿瘤内异质性仍然是实现个性化癌症治疗承诺的最大障碍。本文使用SPLINTR以时间分辨的方式同时跟踪数千个恶性克隆，以确定克隆适合性的原则，这些原则延伸到癌症基因组之外。本文的主要发现表明，无论起源于何种细胞，克隆优势是一种细胞固有的遗传状态，不能归因于统一的转录程序。相反，本文发现转录多样性的增加是克隆适应性的一个一致特征，特别是在更具挑战性的微环境中。使用SPLINTR，还发现Slpi是恶性克隆优势的典型介体，只有在体内才能识别。最后，发现癌症干细胞对整个肿瘤负担的贡献并不均等，恶性克隆输出是一种细胞固有的遗传特性，决定了适应性过程和对化疗的敏感性。值得注意的是，研究需要一个基因简单的癌症模型，以便深入了解恶性克隆适合性的非基因原理。因此，这些原则需要对更广泛的癌症进行进一步评估，以准确识别遗传和非遗传过程对肿瘤内异质性的相对贡献。

教授介绍：

Mark A. Dawson

Dawson教授是墨尔本大学Peter MacCallum癌症中心和癌症研究中心的临床医生兼科学家。他是癌症生物学和治疗学项目的负责人，癌症表观遗传学实验室的组长和血液学系的血液学顾问。他的研究兴趣是研究表观遗传调节因子在癌症的发生，维持和进展中的作用。他是澳大利亚皇家内科医学院和澳大拉西亚皇家病理学家学院的院士。在澳大利亚墨尔本完成临床培训后，他被授予着名的约翰·莫纳什爵士奖学金和剑桥英联邦信托奖学金，他用这些奖学金在剑桥大学完成了博士学位。在获得博士学位后，他被授予首届惠康信托基金会Beit奖奖学金，以继续研究白血病干细胞的表观遗传调控。他的研究确定了一系列癌症的新治疗策略，并帮助为一流的表观遗传学疗法的临床试验奠定了基础。为了表彰他的研究成就，他被选为澳大利亚科学院院士，澳大利亚健康与医学科学院院士，并担任EMBO会员。他获得了多个享有盛誉的奖项，包括国际实验血液学会的McCulloch&Till奖，澳大利亚科学院的Jacques Miller奖章以及2020年年度总理年度生命科学家奖。

参考文献：

Fennell, K.A., et al., Non-genetic determinants of malignant clonal fitnessat single-cell resolution. Nature, 2021.