2021-10-06

Nature Cancer | 双重靶向CAR-T细胞增强抗肿瘤活性并防止实体瘤逃逸

原创 骄阳似我 图灵基因 今天

收录于话题#前沿分子生物学机制

撰文：骄阳似我

IF：60.716

推荐度：⭐⭐⭐⭐⭐

亮点：

1. 本文展示了同时靶向两种肿瘤相关抗原的CAR-T细胞，并提供反式作用CD28和4-1BB共刺激，同时共享相同的CD3ζ-链，可在体内应激条件下产生快速抗肿瘤作用，防止肿瘤再次激发，并防止由于低抗原密度而导致的肿瘤逃逸。

2. 分子和信号学研究表明，采用CAR设计的T细胞表现出T细胞受体相关信号分子的持续磷酸化以及支持CAR-T细胞增殖和长期存活的分子标记。

3. CAR-T细胞的代谢谱显示诱导糖酵解，维持快速效应T细胞功能，但也保留氧化功能，这对T细胞的长期持久性至关重要。

嵌合抗原受体（CAR）-T细胞在恶性血液病中表现出极大的活性。然而，肿瘤细胞中的异质性抗原表达和次优的CAR-T细胞持续性仍然是实体瘤患者实现临床反应的关键方面。目前，一些针对实体瘤抗原的CAR正在进行临床研究，其主要终点是确定所选靶点的安全性。然而，同时识别至少两种抗原的下一代CARs的最佳构建以及适应CARs胞浆内信号结构域的最合适方式的定义仍然具有挑战性。通过将抗原结合部分融合到一个提供共刺激和CD3ζ信号的单个CAR干细胞，产生了具有双重靶向性的单CAR盒。这种设计的主要缺点是难以维持具有去折叠固有特性的组装抗原结合部分的结构完整性。此外，尽管CD28或4-1BB内域提供的T细胞共刺激在促进B细胞恶性肿瘤患者的临床缓解方面同样有效，该领域普遍认为，双重CD28和4-1BB共刺激可通过CD28共刺激促进肿瘤快速消退，但可能需要4-1BB来维持CAR-T细胞的长期持久性。

最佳的T细胞共刺激是在实体瘤的肿瘤微环境中对抗免疫抑制的第一个关键事件。CAR-T细胞中的多重共刺激是通过两个或三个共刺激内域（第三代CARs）串联包含或在表达CD28作为共刺激内域的CAR-T细胞中过度表达4-1BB配体实现的。然而，报告的临床数据并未显示第三代CAR-T细胞在客观临床反应方面的优势，但表明在cis中，共刺激内域可能无法提供促进最佳T细胞活化和存活所需的CD28和4-1BB共刺激的空间分布。

近期，在Nature cancer杂志上发表了一篇名为“Dual-targeting CAR-T cells with optimal co-stimulation and metabolic fitness enhance antitumor activity and prevent escape in solid tumors”的文章，提出了一种基于双靶向、分裂共刺激信号和共享CD3ζ链的方法，该方法专门针对神经母细胞瘤（NB）疾病模型中的两种临床相关抗原GD2和B7-H3，并进一步用另一对靶点间皮素（MSLN）和硫酸软骨素蛋白多糖4验证了该方法（CSPG4）。文章证明所设计的策略可以实现快速和持续的抗肿瘤作用，这是通过优化信号、效应分子签名和CAR-T细胞的代谢适应度来维持的。此外，当肿瘤细胞中抗原表达异质时，双抗原靶向可防止肿瘤逃逸。

本文使用NB作为肿瘤模型，特别是两种肿瘤细胞系（CHLA-255和LAN-1），共表达两种靶向抗原GD2和B7-H3。当CAR-T细胞用于应激条件下时，与GD2.BBζ、B7-H3.28ζ和B7-H3.BBζCAR-T细胞相比，GD2.28ζCAR-T细胞表现出更好的肿瘤控制能力。由于GD2.28ζCAR-T细胞显示出最显著的抗肿瘤活性，但在低剂量下不能完全根除肿瘤，因此本文测试了添加4-1BB共刺激是否可导致如前所述的肿瘤根除。本文以第三代CAR（GD2.28.BBζ）的形式提供了4-1BB共刺激。还构建了同时编码GD2.28ζ和B7-H3.BBζCARs（GD2.28ζ/B7-H3.BBζ）的载体，以使用两个独立的CAR分子提供双重特异性和双重共刺激。结果表明，与应激条件下的GD2.28ζCAR-T细胞相比，GD2.28.BBζ和GD2.28ζ/B7-H3.BBζCAR-T细胞没有表现出优越的抗肿瘤活性。总的来说，这些数据表明GD2.28ζCAR-T细胞在低剂量下最有效地控制肿瘤生长，但不能根除肿瘤。此外，以第三代CARs或双CARs形式提供的4-1BB共刺激不会增强治疗效果。图1 |单或双抗原靶向以及单或双CD28或4-1BB共刺激不会在应激条件下根除肿瘤。

假设GD2.28ζ/B7-H3.BBζCAR-T细胞可能接收到过多的CD3ζ信号，这损害了双重靶向和双重共刺激的有益效果。因此，本文生成了一系列编码在单个逆转录病毒载体中的双CAR，以评估共享的CD3ζ链是否足以为双抗原靶向提供最佳激活信号，以及每个单抗原识别和双靶形式共刺激的作用。发现GD2.28ζ、GD2.28ζ/B7-H3.BB和GD2.28ζ/dNGFR.BB CAR-Ts能够像预期的那样识别肿瘤细胞，因为它们表达功能完整的GD2.CAR。类似地，B7-H3.BBζCAR-T细胞识别肿瘤细胞，因为它们表达完全功能的B7-H3.CAR，而B7-H3.BB CAR-T细胞没有杀死肿瘤，因为CAR缺乏CD3ζ。值得注意的是，本文发现当B7-H3.BB CAR-T细胞共表达dNGFR.28ζ或28ζ时，它们获得细胞溶解活性并向B7-H3+肿瘤细胞释放细胞因子。这表明与抗原结合的不完全B7-H3.BB CAR可以使用由不直接识别抗原的另一部分提供的顺式表达的CD3ζ。此外，当B7-H3.BB CAR与GD2.28ζCAR共表达且两个CAR同时结合其抗原时，与GD2.28ζCAR-T细胞相比，CAR-T细胞释放更高水平的细胞因子，表明4-1BB提供了额外的共刺激效应。在共表达GD2.28ζCAR和dNGFR.BB（阻止B7-H3结合）的T细胞中，4-1BB在促进更高细胞因子释放方面的额外作用被取消，这表明4-1BB的共刺激作用仅在两种CAR结合其靶抗原时介导。图2 |一条单一共享CD3ζ链足以在双特异性CAR-T细胞中转导激活信号。

为了评估B7-H3.BB CAR提供的4-1BB共刺激是否增强GD2.28ζCAR-T细胞的抗肿瘤活性，本文比较了体外和体内GD2.28ζ/B7-H3.BB CAR-T细胞和GD2.28ζCAR-T细胞的功能性。发现所有CAR均在T细胞中表达，未观察到细胞亚群组成的改变。在与NB肿瘤细胞的重复多轮共培养实验中，在第四轮共培养中，只有GD2.28ζ/B7-H3.BB CAR-T细胞继续清除NB细胞。此外，在第三轮和第四轮共培养中，表达GD2.28ζ/B7-H3.BB的T细胞显示出最高的T细胞计数和最高的IFN-γ和IL-2释放。在携带CHLA-255的NSG小鼠中，GD2.28ζ/B7-H3.BB CAR-T细胞不仅表现出优越的抗肿瘤活性，可在应激条件下消除原发肿瘤，还可在肿瘤再次激发时控制肿瘤生长，从而提高存活率。在第14天，用GD2.28ζ/B7-H3.BB CAR-T细胞治疗的小鼠显示出循环T细胞的最高频率，并且在第28天，它们继续具有较高循环T细胞的趋势。图3 |具有分裂共刺激和共享单个CD3ζ的双重靶向促进持续抗肿瘤活性。

本文进行RNA-seq分析以研究B7-H3的添加方式。BB-CAR对GD2.28ζ-CAR增强了CAR-T细胞的抗肿瘤活性和持久性。在没有CAR参与的情况下，发现GD2.28ζ/B7-H3.BB CAR-T细胞显示出与GD2.28ζCAR-T细胞不同的基因表达模式。基因集富集分析（GSEA）表明，糖酵解途径和IFN-γ信号在GD2.28ζ/B7-H3.BB CAR-T细胞中升高。由于糖酵解和IFN-γ途径都被T细胞受体（TCR）信号激活，使用T细胞激活基因集测试了本文的数据集。与表达GD2.28ζCAR的细胞相比，表达GD2.28ζ/B7-H3.BB的CAR-T细胞的转录组富含在T细胞激活时上调的基因，而在T细胞激活时下调的基因富集在GD2.28ζCAR-T细胞中。这些数据表明GD2.28ζ/B7-H3.BB CAR-T细胞具有较高的TCR激活信号基础水平，这与CAR-CD3ζ链和下游信号激酶（如ERK和Akt）的磷酸化增强平行。图4 |分裂共刺激和共享D3ζ促进TCR紧张信号的双重靶向。

与单独表达GD2.28ζCAR的T细胞相比，GD2.28ζ/B7-H3.BB CAR-T细胞的这种效应进一步增强。尽管在基础静息状态下转录组存在差异，初始CAR介导的刺激同样激活了表达GD2.28ζ/B7-H3.BB CAR或GD2.28ζCAR的T细胞，作为具有任一CAR的T细胞的转录组在第1天聚集。然而，在去除抗原刺激后的第5天，表达GD2.28ζ/B7-H3.BB CAR或GD2.28ζCAR的T细胞之间的基因表达出现差异。表达GD2.28ζ/B7-H3.BB的CAR-T细胞在第5天时在与细胞周期和TCR信号相关的途径中表现出富集，表明抗原去除后持续增殖。主成分分析确定第0天、第1天和第5天的CAR-T细胞转录组之间的相对关系。本文的数据集转录组的变异主要由PC1（x轴）上捕获的CAR激活控制。在第0天和第5天，与GD2.28ζCAR-T细胞相比，GD2.28ζ/B7-H3.BB CAR-T细胞显示出更高的PC1分数，这与发现的活跃TCR信号一致。值得注意的是，表达GD2.28ζ/B7-H3.BB的CAR-T细胞与表达GD2.28ζCAR的T细胞获得了额外的转录组差异，后者在PC2（y轴）中被捕获。与细胞周期相关途径的富集一致，发现GD2.28ζ/B7-H3.BB CAR-T细胞的CAR交联后第6天T细胞持续增殖，并且与GD2.28ζCAR-T细胞相比，第6天的T细胞计数几乎增加了两倍，显示出更好的扩增。在代谢分析中，与刺激后第0天和第5天表达GD2.28ζ/B7-H3.BB的CAR-T细胞相比，表达GD2.28ζ/B7-H3.BB的CAR-T细胞显示出更高的糖酵解活性，而在第1天，当表达GD2.28ζ/B7-H3.BB CAR或GD2.28ζCAR的T细胞的激活信号达到最大值时，仅观察到适度的差异。值得注意的是，在表达GD2.28ζ/B7-H3.BB的CAR-T细胞中观察到的糖酵解增强并未破坏先前描述的由4-1BB内域维持的前氧磷代谢曲线，因为与表达GD2.28ζ的CAR-T细胞相比，这些细胞在CAR刺激前后表现出增加的氧消耗率。总之，转录分析、T细胞信号和代谢表明，双靶向、分裂共刺激信号和一个单一共享CD3ζ结构域维持T细胞中的强直TCR信号和代谢适应性，并将其转化为有效和持续的抗肿瘤活性。图5 |具有分裂共刺激和共享CD3ζ的双重靶向促进CAR-T细胞增殖以及糖酵解和氧化代谢。

为了评估GD2.28ζ/B7-H3.BB CAR-T细胞是否因肿瘤细胞中可变抗原表达而阻止肿瘤逃逸，本文利用了NB中GD2表达的异质性水平。将表达GD2.28ζ或GD2.28ζ/B7-H3.BB的CAR-T细胞与显示GD2异质性表达的NB细胞系SH-SY5Y共同培养。GD2.28ζ/B7-H3.BB CAR-T细胞表现出最高的抗肿瘤作用和1型辅助性T细胞因子释放。接下来，本文评估了GD2.28ζ/B7-H3.BB CAR-T细胞是否能够在体内防止肿瘤逃逸。在携带SH-SY5Y的NSG小鼠的低肿瘤负荷模型中，表达GD2.28ζ/B7-H3.BB的CAR-T细胞完全控制肿瘤生长。在用GD2.28ζCAR-T细胞治疗的小鼠中，与用CD19特异性CAR-T细胞治疗的对照小鼠相比，生长中的肿瘤显示暗淡的GD2表达。相反，B7-H3在肿瘤细胞中的表达保持不变，因为该抗原在注入GD2.28ζCAR-T细胞的小鼠中没有靶向性。这些数据表明，当肿瘤含有靶向抗原弱表达的细胞时，表达具有分裂共刺激信号和单个CD3ζ结构域的双靶向CARs的T细胞具有优越的抗肿瘤活性，这可能导致肿瘤逃避单靶向CAR-T细胞治疗。图6 |双靶向、分裂信号和一个单一CD3ζ内域可防止因抗原丢失而导致的肿瘤逃逸。

由于抗原表达的异质性，防止肿瘤逃逸并提供最佳的T细胞共刺激仍然是实体瘤中CAR-T细胞实现临床反应的关键方面。本文通过独立激活CD28和4-1BB通路并调节CD3ζ链介导的信号传导，生成了同时针对两种抗原并提供最佳共刺激和T细胞代谢适应度的CAR-T细胞。

教授介绍：

Gianpietro Dotti, MD

Gianpietro Dotti是North Carolina大学教堂山分校医学教授，主要研究免疫治疗策略，以治疗血液系统恶性肿瘤患者，包括淋巴瘤和白血病，以及神经母细胞瘤等实体瘤。特别是，他在贝勒医学院开发了CD19特异性嵌合抗原受体的程序，并克隆了一种针对人类免疫球蛋白轻链的新型嵌合抗原受体。这种植入人类T淋巴细胞的嵌合分子允许选择性地清除表达人类免疫球蛋白kappa轻链的肿瘤细胞，同时保留表达lambda轻链的B淋巴细胞的正常间隔。

Dotti博士还参与开发基于CAR的策略，以针对实体肿瘤，如儿童患者的神经母细胞瘤和成人患者的三阴性乳腺癌。

在与Brenner博士的合作下，他还开发了一种基于人caspase-9的新型T细胞安全开关的临床阶段。Dotti博士研究的一个重要重点是开发旨在克服肿瘤微环境免疫抑制机制的T细胞工程策略。

参考文献：

Koichi Hirabayashi，Hongwei Du，Gianpietro Dotti et al. Dual-targeting CAR-T cells withoptimal co-stimulation and metabolic fitness enhance antitumor activity andprevent escape in solid tumors.[J] Nature Cancer | VOL 2 | September 2021 | 904–918 | www.nature.com/natcancer