动物细胞培养技术中的一些细节

经传代或换液后生长状况良好的细胞在显微镜下观察下透明度大、折光性强、轮廓不清；用相差显微镜观察能看清部分细胞细微结构，细胞处于对数生长期时也可见到很多处于分裂期的细胞；细胞生长状态不良时，细胞折光性变弱，轮廓增强，胞质中常出现空泡、脂滴、颗粒样物质，细胞之间空隙加大，细胞变得不规则，失去正常生长的特点。

注意事项：

细胞计数板应干净，计数时细胞团超过10%要吹散后重新计数，计数板内有气泡时计数不准，要重新计数。

考核细胞计数的准确性，细胞状态观察。

注意事项：

1、考核无菌操作过程，以及最后细胞是否污染。

2、加入pbs或胰酶需冲到皿壁上，避免直接冲到细胞。

3、考核吹打过程。力道要轻柔，减少机械损伤。吹打过程中不能全部打出，枪不按到底，防止产生气泡。

4、消化细胞时，难消化的细胞如膀胱上皮细胞，可置于37度孵箱消化。消化时间不宜过长，考核消化时间。

细胞消化计数铺板

96孔板内接种细胞悬液（100ul/孔），通常细胞增殖实验（癌细胞）每孔2000，细胞毒性实验cck8用的5000~8000。具体每孔所需细胞数需根据细胞大小，细胞增殖速度因素决定，可以做细胞的生长曲线来决定铺板细胞量。避免气泡产生，培养过夜。复孔设置 3个复孔之间数据差异较大，一般每组设置5~6个复孔。

注意事项：

1、铺板的细胞一定要选择对数生长期的细胞，此时期细胞状态最佳。

2、设置调零孔、对照孔、复孔：同时设置调零孔（培养基、溶解液、MTT），对照孔（细胞、培养基、溶解液、MTT、相同浓度的药物溶解介质），每组设定多个复孔。

3、铺板的均匀度。铺板时应每次吹打混匀加入，防止细胞沉降底部。加样时速度放慢防止冲力过大细胞旋转到孔中部。力求铺板均匀。