2022-08-25

Yeast two-hybrid analysis

原理：

典型的真核生物转录因子，如GAL4、GCN4等都含有两个不同的结构域：DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。DNA-BD和AD单独分别作用并不能激活转录反应，但是当二者在空间上充分接近时，则呈现完整的GAL4转录因子活性并可激活UAS下游启动子，使启动子下游基因得到转录。
在酵母双杂交系统中，“诱饵”（bait）蛋白X构建至BD载体中，表达BD-X融合蛋白；“猎物”（prey）蛋白（待测试蛋白Y）构建至AD载体中，表达AD-Y融合蛋白。
如果bait和prey之间没有相互作用，BD和AD就不会与激活序列结合，报告基因也就不能被激活和表达；反之如果在酵母内，bait和prey相互作用且表达了，那么BD和AD就会与激活序列结合，下游报告基因（抗性筛选、蓝白斑筛选、营养缺陷型筛选等）也就被激活并进行表达。
故，bait和prey是否发生相互作用，即可通过对报告基因的激活表达与否进行检测。
【Reference】 [1]Fields S, Song O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 1989 Jul 20;340(6230):245-6. doi: 10.1038/340245a0. PMID: 2547163

目前酵母双杂交实验采用的系统有 LexA 系统和 Gal4 系统两种。

商品化Matchmaker GAL4 酵母双杂交系统的组成：

1. 载体质粒：pGADT7，pGBKT7，pGADT7-P53，pGBKT7-ADT，pGBKT7-Lam
2. 酵母菌株：AH109（是Trp和Leu缺陷型菌株，无法在缺少Trp和Leu的培养基中生长，因此可以用来进行转化筛选）
   阳性对照：pGADT7-T，pGBKT7-P53
   阴性对照：pGADT7-T，pGBKT7-Lam
   (LaminC蛋白少与其它蛋白相互作用) 假阳性检测质粒
   实验组：pGADT7-X，pGBKT7-Y
   对照组：
   pGADT7-X，pGBKT7
   pGADT7，pGBKT7-Y
   pGADT7，pGBKT7
   说明：载体本身带有-Trp-Leu标记，质粒转化成功即可在二缺培养基上生长。若无相互作用，则四缺培养基无法生长。
   报告系统需要先检测自激活现象，如果存在自激活，没办法进行下去。

实验步骤可以参考：【Protocol】酵母双杂交技术原理及实验步骤http://mp.weixin.qq.com/s?src=11×tamp=1661392688&ver=4003&signature=UXFh33LpPElvVBsUQ1ssgFgpXHA84aTc*Y5HzDSZ0lUTMtpXkTfj1WzsZHjYGY0mEzY526F9QFCBrDy1Sb5g64YYFMODDWdbBxYC0z33-67gsP4A7EtePFqqJoWX3726&new=1
在30℃时，酵母约为2.5 h一代，可据此计算接入的菌量。
鲑鱼精 DNA 为短的线形单链 DNA，可包裹质粒 DNA，在酵母细胞摄取外源质粒
DNA 过程中发挥作用，促进质粒进入酵母细胞，另外还可保护质粒免于被 DNA 酶降解。鲑鱼精 DNA 溶于水，参考浓度 2mg/ml。
PEG/LiAC溶液作用：促进转化

酵母双杂交的局限性：

1.双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后修饰，如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行。
2.酵母双杂交系统的一个重要的问题是"假阳性"，就是自激活，所以实验前都应先对目的基因进行自激活检测。

没有酵母经验的同学推荐阅读
Clontech Yeast Protocols Handbook
https://www.takara.co.kr/file/manual/pdf/PT3024-1.pdf