2021-08-27 学习小组Day7笔记--动感光波

测序技术

第一代测序技术：Sanger测序原理

由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应。在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP，得到片段大小不一致的DNA混合物，然后通过凝胶电泳分离和放射自显影后识别确定待测分子的DNA序列。

特点：读长长（1000 bp），准确性高（99.999%），通量低。

第二代测序技术：边合成边测序（Sequencing by Synthesis，SBS）

在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。

第二代测序技术代表有Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和Life technologies（ABI）公司的SOLiD技术；Life technologies公司的Ion Torrent和Ion Proton技术等，经过不断的竞争，454、SOLiD 和Helicos平台不再开发新的仪器，Illumina平台最终成为市场主流，其方法为边合成边测序。

• 流程：

1.DNA文库构建
将基因组DNA随机片段化，然后通过末端修复、磷酸化、加A等步骤修补成平末端，最后加上特定的接头（Adaptor），构建成DNA文库。
2.簇的生成——桥式PCR
Flowcel上面连有两种接头（P5、P7），当DNA经变性后流经Flowcell时，利用Flowcell上的接头与DNA两端的接头相互匹配。DNA进行桥式PCR扩增，从而将碱基信号放大。通过桥式PCR不断循环获得上百万条成簇分布的双链待测片段。
3.测序
4.数据产出

特点：通量高、时间短、读长短。

第三代测序技术:单分子实时DNA测序

DNA测序时，不需要经过PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序，凭借超长的读长和可直接检测表观修饰等特点使其成为市场的新宠。目前以Pacific Biosciences公司的SMRT技术和Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔单分子技术为主流。
单分子测序技术原理

SMRT技术：

也采用边合成边测序方法，以SMRT芯片为测序载体，芯片上众多小孔中的DNA聚合酶和模板结合，4色荧光标记4种碱基（dATP,dTTP,dCTP,dGTP)，在碱基配对阶段，加入不同碱基会发出不同的光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。另外，若碱基存在修饰，则通过聚合酶的速度会减慢，因此可以通过检测相邻两个碱基之间的测序时间、两峰之间的距离来检测甲基化等碱基修饰情况。SMRT测序速度快（每秒约数个dNTP），但是，测序错误率也较高（达到15%，可通过多次测序进行有效的纠错）。
特点：无需PCR扩增，读长长，无视GC含量的影响

纳米孔单分子测序技术：

纳米孔测序理论自1989年被提出以来，历经近三十年的发展，终于从理论到商业化并得到越来越广泛地应用。该技术的原理是当在膜两侧施加电压，分子马达驱动DNA分子通过纳米孔，导致电荷发生变化，每种碱基引起的电流变化是不同的，通过检测这些电流进而转化为对应的碱基序列。

（我只摘抄了我感兴趣的部分，全文详见测序技术原理及常用数据格式简介 (qq.com)
第三代测序技术详见DNA 测序技术的发展：第三代测序法 (qq.com)
测序发展史详见：测序发展史：150年的风雨历程 (qq.com)
一个非常详细的测序文章测序的世界 - (jianshu.com)
illumina SBS视频原理讲解https://share.weiyun.com/5qojuBY
最后推荐【陈巍学基因】
(感谢生信星球分享资源)

三种测序技术对比

一些高通量测序分类的名词

主要包括基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学。详见下图。

测序类别

small RNA(sRNA)

写在最后

通过一周对生信的接触，感觉很新鲜，也真的很有意思，我很喜欢。在这个过程中，好奇心和好胜心驱使我自我搜索学习了很多，很有成就感和自我价值感。感谢“生信星球”提供的资源，感谢花花和群里小伙伴热心的答疑。如果要独立操作独立分析，未来还有很多要学习的地方，一些基础的理论要自己去了解。路还很长，真心感谢“生信星球”引路。