革兰氏染色的基本原理及方法

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  今天哪也不想去,就宅在家里整理一下资料吧!先来学习一下革兰氏染色吧!

  革兰氏染色法是1884年由丹麦医师Gram创立。至今仍是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法。

  细菌先经碱性染料结晶紫染色,而后经碘液进行媒染,之后用酒精脱色.在一定条件下,有的细菌媒染后的颜色不被脱去,有的可被脱去,因此把细菌分为两大类。前者叫做革兰氏阳性菌(G+)后者为革兰氏阴性菌(G-).为方便进一步观察,脱色后可再用碱性染料蕃红进行复染,阳性菌呈紫色,阴性菌呈红色。

  革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚,肽聚糖网层次较多且交联致密,故遇乙醇或丙酮脱色处理时,因失水反而使网孔缩小,再加上它不含类脂,故乙醇处理不会出现缝隙,因此能把结晶紫于碘复合物牢牢留在壁内,使其仍呈紫色;而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄,外膜层类脂含量高,肽聚糖层薄,且交联度差,在遇脱色剂后,以类脂为主的外膜迅速溶解,薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出,因此通过乙醇脱色后仍呈无色,再经沙黄或蕃红等红色染料复染,就使革兰氏阴性菌呈红色。


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了解了原理以后,咱们就来看看染色步骤吧!一般包括四个步骤:初染、媒染、脱色、复染。接着就来了解一下具体染色方法以及一些注意事项。

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(一)涂片,干燥

  1.在干净的载玻片中央滴加一滴蒸馏水,如用移液枪,大约就10ul就可以。

  2.然后用接种环(灭菌后冷却)或用一次性环,无菌操作,挑取少许培养物(粘一下,不要用力),如果是纯菌单菌落时,碰一下就很多了,别用力粘到都看得见,那就很多了(切记),然后置载玻片的水滴中,与水混合做成菌悬液并涂成一个薄片,如涂抹后不易观察,可提前用记号笔在玻片反面画一个圈作一个标记。

  3.干燥:最好在室温条件下,使其自然干燥,有时为了使之干得更快些,可用手拿着迎风甩干或放在生物安全柜风口上。

  4.干燥后即过火固定,固定的目的有三个:(1)杀死微生物,固定细胞结构。

(2)保证菌体能更牢固的粘附在载玻片上,防止标本水洗时被水冲掉。

(3)改变染料对细胞的通透性,因为死的原生质比活的原生质易于染色固定。

利用高温,手执载玻片一端,标本向上,快速通过酒精灯火焰外层3-4次,共约2-3s,玻片接触皮肤,在手背上轻轻拍,目的是看有多高温度,接触不太烫,又有温度,说明过火最合适。

  (二)然后,进行染色

  在固定过的涂片菌膜上滴加结晶紫染色液,多滴两滴,染色液覆盖住菌膜,计时1min.

  (三)水洗

  染色到一定时间,可以用洗瓶从玻片一边慢慢冲水,注意水流要慢,毕竟固定过火都是虚松的,太急容易把菌冲没,只需细小的水流把多余的染料冲洗掉,被菌体吸附的染料则被保留。

  (四)媒染

  直接滴加碘液(不需要干燥)覆盖涂抹面,染1min,这时紫色的印记就变的有点黑(碘的结果)媒染剂与染料形成不溶性的化合物,增加染料和细菌的亲和力。注意媒染时间控制在50~60s为宜。时间过长,结晶紫在碘液长时间作用下过分牢固结合,在菌体细胞壁上,影响酒精脱色效果,从而会导致假阳性的效果。

  (五)水洗

用细小的水流(温柔的)冲洗掉涂片上的染色液,用吸水纸吸干。

  (六)酒精脱色。

  斜向下拿住玻片使之成30-45°角,然后滴加酒95%酒精,酒精可以倒入洗瓶内,一口气缓缓的捏着冲洗一遍,酒精顺着玻片蔓延到中间,经过菌液,玻片下边开始往下滴,刚开始滴下来的呈黑色,慢慢变淡,然后无色,无色的瞬间赶紧换水冲洗,还是从上面往下冲洗,赶紧把酒精冲掉,洗脱时间一点要掌握好,控制在20-30s之间,否则,酒精脱色时间短,脱色效果不佳,会导致阴性菌体内的结晶紫和复合物不能有效的全部洗脱出来,出现误差,使阴性菌出现假阳性。如果洗脱时间过长,也会导致阳性菌的细胞壁被酒精破坏导致细胞内的紫色被洗脱,呈现假阴性,因此洗脱时间也是革兰氏染色的关键环节。

  (七)复染

  蕃红染色液,染色10s后,自来水洗掉,滤纸贴一下,玻片不要滑动,滤干多余的水

  (八)镜检

  油镜观察,注意油不要太多,等玻片干了再加,湿的时候有水会产生气泡,不易观察。

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  好了,墨迹半天了!就到这里吧!在这里要感谢一下一位烦人的老师!至于他是谁就不提了!总之跟他学到了很多知识!感谢的话就不多说了!

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