细胞冻存的必要性
连续培养的细胞系容易发生遗传漂变，有限细胞系最终会发生衰老，所有培养的细胞都易受到微生物污染，即使运转情况最好的实验室也会遇到设备故障的问题。
由于已建立的细胞系是一种宝贵资源，更换细胞系成本高昂，而且耗费时间，因此，必须将其冷冻起来，长期保存。
冻存培养基的选择
冻存细胞时必须选择冻存培养基。
冻存培养基中应含有DMSO或者甘油等冷冻保护剂。
还可使用专门配制的完全冻存培养基。
细胞冻存：慢
1.悬浮细胞
细胞应处于对数期。细胞计数，应以约800-1000rpm离心5分钟沉淀细胞，移去上清到最小体积，不要搅乱细胞。
以5-10X106细胞/ml密度，在冻存液中再次悬浮细胞
分装进冻存管，冻存管必须旋紧，密封
细胞以1℃/分钟进行冷冻，可以通过程序降温仪保存冻存管到-80℃冰箱中，然后转移到液氮罐中贮存。
2.贴壁细胞
胰酶消化细胞，计数，离心收集细胞
在完全生长培养基中，再次悬浮分离细胞，确定有活力的细胞数
在大约1000rpm，5分钟沉淀细胞，移去上清到最小体积，不要搅乱细胞
以5-10X106细胞/ml密度，在冻存液中再次悬浮细胞
分装进冻存管，冻存管必须旋紧，密封
细胞以1℃/分钟进行冷冻，可以通过程序降温仪保存冻存管到-80℃冰箱中，然后转移到液氮罐中贮存。
冻存细胞的复苏：快
冻存细胞较脆弱，要轻柔操作。冻存细胞要快速融化，并直接加入完全生长培养基中。若细胞对冻存液敏感，离心去除冻存培养基，然后加入完全生长培养基。
1.直接铺板方法
从液氮罐中取出冻存管，37℃水浴中快速融化（注意安全防护）。
1ml细胞冻存液加入到10ml完全生长培养基，37℃，5% CO2培养。
培养细胞12-24小时，更换新鲜的完全生长培养基，去除冻存液。
2.离心方法
取出冻存细胞，37℃水浴中快速融化
把1ml冻存细胞加入到约9ml完全培养基，轻轻混匀
以大约800-1000rpm离心5-10分钟，弃去上清
在完全培养基中再次轻轻悬浮细胞，37℃，5% CO2培养
细胞铺板、细胞接种应至少为3X105活细胞/mL。
为什么冻存管会发生爆炸？
•不同的材料的收缩速率不同。在降温过程中难免会产生微小的缝隙，此时会有少量液氮进入到冻存管内。
•在“复苏”冻存样品的时候，如果冻存管的缝隙内残留有液氮，放入37℃水浴时，将会发生爆炸，造成样品的损失和实验人员的伤害。
•我们不推荐将塑料冻存管放置于液氮罐中液体表面以下。
•如果确实需要在液氮中放置保存，建议一定要使用额外的保护措施。
冻存的注意事项
1.注意个人防护
•面罩、手套、防护服
2.液氮液相储存样品
•对冻存管额外的保护，防止液氮渗漏或炸管
•防止样品间交叉污染，如支原体
•对于未经保护的冻存管在复苏时需注意安全
了解细胞培养相关专题，敬请关注生物医学科研实验！
（转自Cellmax俱乐部）