全外显子组数据分析笔记（五）：变异注释

我用的是ANNOVAR。

如何下载

搜索ANNOVAR Documentation，进入主页。

点击here之后会出现注册界面。

完成注册留下邮箱之后，就能收到附有下载链接的邮件了，需要等一两天。
http://www.openbioinformatics.org/annovar/download/0wgxR2rIVP/annovar.latest.tar.gz，这是我收到的链接，下载解压出来就能看到这些了

简单介绍

Annovar可以实现三种不同的注释方法，Gene-based Annotation（基于基因的注释）、Region-based Annotation（基于区域的注释）、Filter-based Annotation（基于筛选的注释）

基于基因的注释：确定SNP或CNV是否导致蛋白质编码变化和确定受影响的氨基酸。可灵活使用RefSeq genes, UCSC genes, ENSEMBL genes, GENCODE genes或许多其他基因定义系统。
基于区域的注释：识别特定基因组区域的变异，例如，44个物种中的保守区域，预测的转录因子结合位点, segmental duplication regions, GWAS hits, ChIP-Seq peaks, RNA-Seq peaks等等许多其他的在基因组区间的注释；
基于过滤的注释：鉴定特定数据库中记录的变异，例如，该变异位点是否在dbSNP中有报道，在千人基因组计划中的等位基因频率如何等等。

使用

1. 配置数据库

http://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/user-guide/download/#additional-databases官网里面提供了该软件支持的数据库列表（都是人的数据库），有很多，并且经常更新。

也可以在终端下查看：

mkdir humandb_hg38/
annotate_variation.pl -downdb -webfrom annovar avdblist humandb_hg38/ -buildver hg38

-buildver        表示version，主要是hg19和hg38；
-downdb          下载数据库的指令；
-webfrom annovar 从annovar提供的镜像下载，不加此参数将寻找数据库本身的源；
humandb_hg38/    下载到的文件都存放于humandb_hg38/目录下

查看列表
lsx humandb_hg38/hg38_avdblist.txt

数据库文件、更新时间、文件大小

annotate_variation.pl -buildver hg38 -downdb -webfrom annovar refGene humandb_hg38/

注意这里的数据库名称，比如refGene，都是严格按照上面红框里面的名称来的。将需要的数据库按照这条命令都下载好就行了。

2. vcf to avinput

将VCF文件转化为annovar可以识别的格式

perl ~/annovar/annovar/convert2annovar.pl -format vcf4 snp.vcf > snp.avinput
perl ~/annovar/annovar/convert2annovar.pl -format vcf4 indel.vcf > indel.avinput

简单看一下二者的区别

前五列分别代表：染色体, 起始位点, 终止位点, 参考碱基和观测到的碱基；
第六列：纯合变异（Homogeneous），杂合变异（Heterogeneous）；
第七列：取自vcf文件中的QUAL列，表示该位点存在突变的可能性；
第八列：取自vcf文件中INFO列的DP信息，表示该位点的覆盖深度。
ANNOVAR主要依靠前五列信息对数据库进行比对，进而注释变异。

3. 进行注释

table_annovar.pl可以一次完成三种类型的注释，需要输入avinput文件和前面配置好的数据库文件。如果是一次完成一种类型的注释，则选用annotate_variation.pl。

perl ~/annovar/annovar/table_annovar.pl ./snp.avinput \
~/annovar/annovar/humandb_hg38/ -buildver hg38 \
--protocol avsnp150,cosmic70,clinvar_20180603,dbscsnv11,gnomad_exome,esp6500siv2_all,exac03,ensGene,refGene,knownGene \
-operation f,f,f,f,f,f,f,g,g,g \
--nastring "." \
--remove \
--outfile ./snp.annovar

perl ~/annovar/annovar/table_annovar.pl ./indel.avinput \
~/annovar/annovar/humandb_hg38/ -buildver hg38 \
--protocol clinvar_20180603,exac03,ensGene,refGene,knownGene \
-operation f,f,g,g,g \
--nastring "." \
--remove \
--outfile ./indel.annovar

--protocol        逗号分隔的字符串，用来指定数据库；
--operation       逗号分隔的字符串，用来指定注释方法，r基于区域g基于基因f基于过滤；
--nastring "."    当有缺失值时，用.填充；
--remove          移除所有临时文件.

结束之后会得到这两个文件：snp.annovar.hg38_multianno.txt，indel.annovar.hg38_multianno.txt。文件名前面的snp/indel是依照输入文件snp.avinput和indel.avinput来定的，后面的annovar.hg38_multianno.txt是程序自己加的。

reference

ANNOVAR 注释软件: https://blog.csdn.net/herokoking/article/details/78790688