一条兔子
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构建基因共表达网络鉴定CD8 T细胞浸润相关生物标志物在肾透明细胞癌中的作用

构建基因共表达网络鉴定CD8 T细胞浸润相关生物标志物在肾透明细胞癌中的作用

文章目录

  • 构建基因共表达网络鉴定CD8 T细胞浸润相关生物标志物在肾透明细胞癌中的作用
    • 文献信息
    • 背景和目的
    • 实验流程
    • 方法和结果
      • 从GSE73731下载CCRCC的数据，并进行预处理
      • 使用CIBERSORT评估每个样本中T细胞所占的比例
      • WGCNA得到共表达网络以及模块和性状的相关性
      • 使用metascape进行通路富集
      • 寻找hub基因
      • 确定hub基因是有意义的
    • 差异分析和生存分析
      • image-20200501095838705
      • 整合（荟萃）分析
      • GSEA
      • 研究敲低ccl5对CCRCC细胞的侵袭性的影响
    • 结论
    • 心得

文献信息

- 杂志：AGING
- 发布日期：2020年2月
- 影响因子：5.515
- 文献地址：[点击这里](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7066925/)

背景和目的

  • CD8 T细胞有助于肿瘤的适应性免疫，有助于治疗，但是CD8 T细胞又与RCC中的高浸润和不良预后相关
  • 先前的研究报道了一些与RCC 的免疫相关的生物标记物，但是都不能直接应用于是的临床工作
  • 所以作者认为，鉴定与CD8 T细胞有关的生物标记物将有助于检测RCC免疫治疗反应和探索免疫浸润机制

实验流程

构建基因共表达网络鉴定CD8 T细胞浸润相关生物标志物在肾透明细胞癌中的作用_第1张图片

方法和结果

从GSE73731下载CCRCC的数据，并进行预处理

- 首先利用limma包进行保准化
- 筛选出**方差大于0.1的基因（4411个）**进行下一步分析

使用CIBERSORT评估每个样本中T细胞所占的比例

首先介绍一下CIBERSORT这个网站

这个网站使用的是去卷积的方法，通过输入的标准化的表达谱数据以及网站自带的22种免疫细胞的基因表达量，得到一个样本中免疫细胞的比例矩阵（浸润到肿瘤组织的免疫细胞）。关于这个网站的使用方法可以参靠这个网站

需要注意的是：输入的表达谱一定一定不要有缺失值，包括第一行第一列，否则就会报错，并且上传一次文件经常要好久好久！

作者j将得到的4411个基因的表达谱作为输入文件，使用了CIBERSORT工具计算各个样本中免疫细胞所占比例的评估，并只留下了T细胞的比例（因为作者只对T细胞感兴趣），用来当做WGCNA的性状文件

构建基因共表达网络鉴定CD8 T细胞浸润相关生物标志物在肾透明细胞癌中的作用_第2张图片

​ （作者提供的结果）

构建基因共表达网络鉴定CD8 T细胞浸润相关生物标志物在肾透明细胞癌中的作用_第3张图片

​ （我在CIBERSORT网站中跑出来的结果）

WGCNA得到共表达网络以及模块和性状的相关性

  • 首先利用4411个差异基因的表达谱数据用于制作共表达网络，找到共表达的模块

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  • 使用上一步得到的结果用作WGCNA的性状文件，从而得到各个模块与形状之间的相关性

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  • 由于作者这篇文献主要是研究CD8 T细胞，并且只有绿色模块和CD8 T细胞的相关性大于0.5，所以选择绿色模块进行下一步分析

使用metascape进行通路富集

关于metascape这个网站的介绍可以看这里

将绿色模块的基因放入到metascape进行通路富集，结果显著富集在了淋巴细胞激活，适应性免疫应答和细胞因子介导的通路上。说明作者找到的模块基因确实和免疫功能相关。

构建基因共表达网络鉴定CD8 T细胞浸润相关生物标志物在肾透明细胞癌中的作用_第6张图片

寻找hub基因

作者寻找hub基因这个地方，我看的不是很懂，有讲的不清楚的地方，大家还是去看原文吧，请见谅

  1. 利用模块基因与免疫细胞的相关性和模块基因之间的相关性来筛选出模块基因中的30个基因。

    构建基因共表达网络鉴定CD8 T细胞浸润相关生物标志物在肾透明细胞癌中的作用_第7张图片

    图中的绿色基因就是刚才找到的绿色模块中的所有基因，红色框内的就是坐着筛选出来的30个基因

    图中横坐标是基因之间的相关性，纵坐标是基因与CD8 T细胞的相关性，都是从TIMER数据库中获取的

    谢谢评论区大佬纠正，大佬指路之后我在WGCNA的文献中找到了关于筛选模块基因中的hub基因的方法的描述：

    构建基因共表达网络鉴定CD8 T细胞浸润相关生物标志物在肾透明细胞癌中的作用_第8张图片

    可以看出横坐标的MM是基因和模块基因的特征向量之间的相关性，其中E是模块基因的特征向量，相当于是把模块基因的表达谱先降维，再取相关了，其实MM的含义就是基因对模块基因的贡献，MM越接近1或者-1，也就代表着基因越能代表这个模块基因，也就越可能是hub基因。

    纵坐标指的是纵坐标是基因与CD8 T细胞的相关性（GS），相关性是作者从TIMER获取到的。

    构建基因共表达网络鉴定CD8 T细胞浸润相关生物标志物在肾透明细胞癌中的作用_第9张图片

    ​ （TIMER网站主页的介绍）

  2. 将模块中所有基因做蛋白互作网络图，找出其中30个关联边超过15条的基因节点作为中心节点。

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    ​

  3. 将上面得到的两个基因集进行取交集，得到的10个基因作为hub基因。

    ​ 构建基因共表达网络鉴定CD8 T细胞浸润相关生物标志物在肾透明细胞癌中的作用_第11张图片

确定hub基因是有意义的

作者这里为了确认找到的hub基因是有意义的，使用了TIMER这个数据库查看了hub基因与CD8 T细胞的相关系数

​ 构建基因共表达网络鉴定CD8 T细胞浸润相关生物标志物在肾透明细胞癌中的作用_第12张图片

免疫刺激因子，免疫抑制因子，受体，趋化因子

差异分析和生存分析

作者随后对找到的hub基因进行差异分析和生存分析

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构建基因共表达网络鉴定CD8 T细胞浸润相关生物标志物在肾透明细胞癌中的作用_第14张图片

构建基因共表达网络鉴定CD8 T细胞浸润相关生物标志物在肾透明细胞癌中的作用_第15张图片

​ 发现找到的hub基因在肿瘤和正常中都存在显著差异，并且与肿瘤分期和肿瘤分级都有显著的关系

构建基因共表达网络鉴定CD8 T细胞浸润相关生物标志物在肾透明细胞癌中的作用_第16张图片

只有CCL5和IFNG和预后有显著的关系

整合（荟萃）分析

作者使用ONCOMINE数据库进行了荟萃分析，进一步验证了自己hub基因在肿瘤与正常样本之间的差异

构建基因共表达网络鉴定CD8 T细胞浸润相关生物标志物在肾透明细胞癌中的作用_第17张图片

图中median Rank代表五次分析中的中位值，从图中可以发现找到的hub基因除了IFNG（数据库中没有这个基因的数据）在癌症样本相对于正常样本都显著的上调了。

GSEA

利用CCL5的表达中值，将样本分为了高表达组和低表达组进行GSEA分析

构建基因共表达网络鉴定CD8 T细胞浸润相关生物标志物在肾透明细胞癌中的作用_第18张图片

富集出来的三个通路都和免疫有关

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研究敲低ccl5对CCRCC细胞的侵袭性的影响

构建基因共表达网络鉴定CD8 T细胞浸润相关生物标志物在肾透明细胞癌中的作用_第20张图片

  1. C图使用小干扰RNA降低ccl5的表达
  2. D发现敲低的样本癌症细胞的增殖能力下降了
  3. E图细胞的侵袭能力下降了

结论

作者认为他的分析成功的找到了一个可以作为ccRCC的生物标志物的基因。

心得

  • 第一次接触免疫相关的文献，学习到了很多免疫分析相关的好用的网站，例如CIBERSORT和TIMER
  • 对WGCNA有了更进一步的了解

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按字母分类： ABCDEFGHIJKLMNOPQRSTUVWXYZ其他