【前言】
从本期起，小编将带领大家使用殷赋云计算平台（http://cloud.yinfotek.com/）来做一系列计算“文章”。这一期咱们来重现一篇2018年文献[1]的计算结果，看看作者是如何运用分子对接技术来阐明机理、升华文章的。该文献影响因子4.6，是典型的“实验+计算”模式，比较接近大多数科研人员的研究现状，只要熟悉这种模式，稍加努力即可发表同等水平的论文。
【研究背景】
文献作者通过细胞MTT试验从8000多个小分子中发现了一个新型的抗流感病毒化合物D715-2441。进一步实验发现，它对流感A病毒多种亚型（H1N1、H5N1、H7N9、H3N2、临床分离株690（H3）和带H274Y NA变异的奥司他韦抗性株）均有抗病毒活性，能够抑制病毒复制的早期阶段。更重要的是，D715-2441明显抑制病毒聚合酶的活性，并且直接影响PB2蛋白的定位。结合亲和力分析明确了该化合物特异性结合在PB2cap蛋白上。为了阐明抑制剂D715-2441的作用机理，文献作者采用DOCK 6分子对接技术分析其结合模式。
【计算步骤】
简单来说，分子对接的计算步骤包括4步：
1、 准备配体（小分子）和受体（生物大分子，比如蛋白）结构；
2、 定义对接口袋；
3、 进行对接计算；
4、 分析对接结果（打分与结合模式分析）。
下面，小编图文并茂地教大家使用殷赋云计算平台的DOCK6方案来完成对接计算与分析。本教程不打算详尽地讲解每一个操作步骤，仅将大体过程和关键要点讲清楚。但讲了很多值得注意的细节，这是一般教程上看不到的经验之谈。读者如果对本平台操作不是很熟悉，请翻看相应教程（分子对接结合模式预测教程）。
1、 创建项目和任务
登录平台，创建项目，填写内容。“简略备注”和“详细描述”是给你自己看的，可不填，但填写备忘是个值得鼓励的好习惯。然后，选择计算方案或工具。在这里，我们选择跟文献同款的Dock6（结合模式预测）方案。之后，填写任务内容。
2、 准备配体分子
平台为准备配体分子提供了多种输入方式，最简单的莫过于在线画结构（绘制小分子）。在画板上画出D715-2441的化学结构，并填上分子名称（不要有中文、空格、特殊符号或除英文字母外的其他语言文字！）和点击添加按钮。
输入的分子需要经过处理才能用于对接，其中包括：添加氢原子、添加电荷、生成3D结构和能量最小化。平台已对大多数情况进行优化设计，因此，采用默认设置即可。
值得注意的是：1、MMFF94力场是目前针对有机小分子最好的力场之一，也包括一些金属元素[2]，但并非化学元素周期表全部元素都支持，必要时请使用UFF力场；2、电荷和能量优化使用的力场最好一致。
点击准备按钮。
我们从视图中看到经过处理的配体结构。尽管平台已经做得很好，但人工检查仍是必要的。请根据你的化学知识，仔细检查结构是否正确，比如价键是否平衡、结构是否无扭曲、构型是否正确。确定无问题后，点击确定按钮；否则，返回前面，重新画结构或采用其他输入方式。
3、 准备受体分子
与配体不同，受体分子通常是生物大分子，结构大而复杂，无法手绘准备。通常采用实验解析的结构，可从RCSB 蛋白数据库下载。本工作用到的PB2cap蛋白PDB编号是4CB4。平台提供了两种输入方式：1）输入PDB ID；2）上传PDB文件。这里采用第一种方式。
通常来说，从PDB库下载的晶体结构文件里边包含了很多组分，不仅有（单条或多条）肽链，通常还有有机小分子和溶剂分子（水分子、金属离子）。如果下载的是NMR结构，还可能包含多个蛋白构象（称为model）。
在准备受体结构这一步，我们需要定义选用哪个模型（默认为1）、哪部分结构归为受体、哪部分为配体（将被提取出来用于口袋定位；若没有，可不定义）和其他杂质。在这里，我们选择A:PROTEIN为受体，A:MGT1484为配体，没有选上的部分将在后续处理中被程序删除。
4、 定义对接口袋
我们需要定义化合物D715-2441结合的大致区域——对接口袋。在上面的步骤中，我们提取了晶体结构中原先就存在的配体分子。通过文献了解到，它的结合位置就是D715-2441可能的结合区域。事实上，对该蛋白而言，也只有这里才靠谱。
通过选择文件方式，从弹出的文件列表选择MGT.pdb，点击显示盒子。稍等片刻，视图中将出现一个绿色盒子将MGT分子包围。我们需要保证的是，该盒子足够大，能够把口袋包围住。默认设置基本足够，必要时可增大小球范围（可能导致盒子扩大）。然后点击生成格点。这一步通常比较久，请耐心等待。然后，点击确定按钮。
5、 提交计算任务
Dock6方案为我们提供了多种对接计算模式，这里稍微解释一下。
在各种模式中，蛋白受体都是刚性不动的。因为Dock6的Grid算法实际上并非直接采用蛋白结构进行对接，而是采用其模型（正是前面生成的格点）。根据配体运动的方式，分为下面几种情况：
1） 柔性配体对接，即配体在对接过程中是柔性可变的，可旋转单双键产生不同构象。这是最常用的默认的模式；
2） 固定锚点对接，即在口袋中对配体进行小范围构象搜索，配体有一块结构（通常为最大的刚性结构）看似被固定住，而其他部分则可变动。该模式的用处是，在保持配体整体结合位置不变的情况下，寻找更好的结合模式；
3） 刚性配体对接，即配体是刚性的，不能旋转化学键，仅可整体平移和翻转。可能的使用场景是，配体的构象具有某种特殊意义，希望对接后保持不变，或者评估蛋白是否能够容纳这种构象；
4） 原位优化（in-situ minimization），即在口袋中对配体分子进行能量优化，不进行构象搜索。可用于优化配体的结合模式；
5） 打分评价，即对口袋中的配体分子进行打分评价，不进行构象搜索。可采用不同打分函数对配体某一结合模式进行重打分。
我们采用柔性配体对接模式，其他参数采用默认值，然后提交任务。
6、 对接结果分析
1） 查看对接打分
Dock6方案的对接总打分是Grid Score，负值表示有结合，正值表示不结合，因此，打分值越小（负值的绝对值越大）表示结合力越强。它与另外两项能量项——范德华力和静电力——的关系是：Grid Score = Grid_vdw + Grid_es。Internal Energy是分子内能，表示对接构象（pose）的张力大小，正值，越小越好，通常20 kcal/mol以下比较合理。Pose列是对接构象编号，按照Grid Score从小到大排列。因此，第一个pose即为对接软件根据打分判断为最好的对接构象。
根据经验，Grid Score>-40 kcal/mol属于结合力较差，-40~-50kcal/mol属于中等，<-50kcal/mol属于较好。由于D715-2441分子较小，所以疏水作用面积小，范德华力贡献自然较小，静电力贡献通常也不会很大，导致整体打分较差。这是可以理解的，也应理解为该对接构象还算合理。
从打分分布看，各个pose的打分相差不大，范德华力贡献为主，第一个pose的静电力贡献相对其他pose出奇地大，意味着它具有较多较强的静电作用力（比如氢键和盐桥）。
2） 分析相互作用
仔细观察各个pose，结合上面的对接打分。我们认为第一个pose 的作用力最多，结合力最好，结合方式符合预期，是最好的构象。对比文献，这个pose与之几乎完全一致（下面会解释差异之处）。因此，我们选择它来做结合模式分析。
为清晰起见，点击视图右侧Protein下的cartoon按钮，去掉cartoon样式。点击Ligand下的center按钮，居中显示配体。我们清晰地看到，化合物D715-2441的芳环结构夹在H357的咪唑环和F404的苯环之间形成三明治结构，并与之分别形成π-π堆积作用（黄线），还有与F404的疏水作用（灰线），这些作用力一起构成了范德华力，提供了约-35.48kcal/mol的结合力贡献。另一方面，E361的羧基和K376的质子化N原子同时与苯环上的羟基形成氢键，氢键距离、角度可从下方表格查到。F404骨架上的氧原子也与D715-2441另一个羟基形成氢键作用。与文献不同的是，K339的N+原子和H357的咪唑基都跟环酯基形成盐桥作用。这种作用通常认为是非典型的，所以文献未提及，但在我们的检测分析工具里，它被呈现出来。这些极性作用为化合物的结合提供了较强的静电力贡献（约-7.69kal/mol），这也是该pose相对其他pose而言静电力非常显著的原因。
跟文献存在差异的另一个地方是，文献显示Phe323与化合物存在π-π堆积作用，Phe325存在疏水作用。但在我们的分析结果中，并没有出现这两个作用力。实际上，这两个氨基酸残基距离底物稍远，刚好超过该分析工具的相互作用力几何判断标准。但若将其原子结构显示出来，即发现也在附近（下图）。在柔性配体对接模式下，蛋白是刚性的，蛋白口袋的形状、残基位置未必是与配体最契合的。普遍认为，蛋白-配体之间存在“诱导契合”效应。在真实情况下，由于分子热运动，蛋白、配体间距离不可能一成不变。对接计算只是展示了其静态的一面，在真实世界里，几何距离在临界点附近的作用力可能“若隐若现”。
【下期预告】
高质量的文章需要高质量的Figure。小编将在下期教大家使用PyMOL做上乘的蛋白-配体结合模式图。敬请关注~
【参考文献】
[1] Teng et al. A Small-Molecule Compound Has Anti-influenza A Virus Activity by Acting as a “PB2 Inhibitor”. Mol. Pharmaceutics, 2018, 15 (9), pp 4110-4120. DOI: 10.1021/acs.molpharmaceut.8b00531
[2]https://open-babel.readthedocs.io/en/latest/Forcefields/mmff94.html#mmff94-force-field
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