精准大海捞针--CRISPR screening专题

由于Addgene的篇幅太长，因此决定分为至少两个部分来介绍。
上期：来自Addgene的CRISPR指南（1）
参考：CRISPR Guide

由于这个部分已经不是简单的看CRISPR guide了，中间还有查阅资料，文献阅读的工作，因此没有再冠以CRISPR Guide的名字。

9. Genome-Wide Screens Using CRISPR 精准大海捞针，必学！

某天晚上我和师妹在微信上描述CRISPR screening实验时，她表示惊叹说，师姐这难道不是精准的大海捞针吗？因此本期我们的文章标题使用了师妹非常精辟的描述。在平时，我们要研究某基因的功能只能通过单独敲低/敲除、过表达的方式，而CRISPR screening允许我们同时进行上万个这样的操作，一次搞定基因组范围的基因编辑，确可谓：精准大海捞针。

1. CRISPR Library

高通量是新时代生物技术的标配，从能一次完成超过5万个基因的PCR（RNA-seq）到细胞谱系追踪（barcoding），在不影响研究精准度的情况下，大大的降低科学研究时间和成本。依据我们前面的介绍，sgRNA将Cas9蛋白靶向至目的序列，Cas9结合到DNA上后剪切DNA，那么以下这几种情况则非常好理解：
（1）Cas9 + 1个sgRNA：针对一个基因进行编辑；
（2）Cas9 + 2个sgRNA：可针对两个基因进行编辑，或者可敲除两个sgRNA之间的大DNA片段；
（3）Cas9 + 多个sgRNA：可同时对多个基因进行编辑；
（4）Cas9 + 上万个sgRNA：同时对上万个基因进行编辑。

针对第3、4种情况，这多个sgRNA的合集被称为CRISPR文库（CRISPR Library），文库的大小可从几十个sgRNA到十几万个sgRNA。文库的出现使得我们可以同时对上万个基因进行编辑，再筛选出对某特定表型有明显作用的基因集，用于指导下一步研究，这一过程称为CRISPR screening，举例如下图：

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从上图中可以看出，CRISPR Library是包含sgRNA的pool（A-C），并通过慢病毒转导的方式转入Cas9稳定表达或野生型细胞（D），pool sgRNA感染的细胞经过特定特征（耐药性等）区分后，通过NGS测序鉴定与特定特征相关的基因集。除了常规流程的展现，我们还需要注意到构建pool library的工作量是相当大的，如张峰教授组的GeCKO v2 Library可针对19,050个编码基因，而为了提高编辑效率，每个基因都设计了至少6个sgRNA，因此整个library包含有123,411个sgRNA，每个sgRNA都要构建出相应质粒，整个library的构建花费不菲，而我们只需要用500美元即可从Addgene上购得，能够使用这样的工具，真得感谢这些巨人们。

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2. CRISPR Library的类型

CRISPR Library的类型也根据实验目的、物种、文库大小和投递方式分类，具体信息可以在Addgene网页上可以查看：

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在设计CRISPR screening实验之前需要思考以下问题：
（1）CRISPR screening在准备阶段需要使用电转的方式扩增文库，并需要NGS测序来确定文库丰度，尽管目前已经有一些library可以选用化学感受态细胞进行扩增，但选用library之前一定要查阅清楚；
（2）CRISPR screening实验需要大量的细胞，因此对于一些无法扩增、数量有限且非常珍贵的细胞时，如原代细胞等，CRISPR screening则可能不适用；
（3）大多数CRISPR文库需要使用慢病毒将gRNA/Cas9传递到目标细胞。

因此，使用者需要充分考虑课题组的条件是否能达到以上要求。一旦确定实验条件适合，那么下一步就是选择library，在选择文库时，也需要考虑以下几点：
（1）基因修饰的类型：敲除、激活还是抑制目标基因；
（2）gRNAs的数量：CRISPR Library可以针对整个基因组或某一类特定的基因，例如最近报道的用于增强CRT T细胞在实体瘤中活性的TCR pool knockin CRISPR Library，只有36个目的基因。
（3）物种：特定的CRISPRLibrary中的gRNAs对于特定生物体的基因组是唯一的，并且文库只与来自该生物体的细胞兼容。
（4）library骨架：如骨架中已有Cas9，则直接使用即可；如骨架中无，需要搭配使用Cas9质粒或者要求细胞本身就表达Cas9。

3. CRISPR Library的结构

大部分的CRISPR Library都需要使用慢病毒投递系统，一般有这几种骨架：LentiCRISPR和lentiGuide-Puro（如下图）等，区别在于前者的骨架中已带有Cas9，因此是一个质粒系统；而后者需要叠加使用一个Cas9质粒。

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每个CRISPR文库都是不同的，然而大多数CRISPR文库有几个共同的特性：首先，每个基因文库通常包含3-6个gRNAs，以确保每个靶基因的编辑效果，因此CRISPR文库包含数千个针对多种基因的独特gRNAs；CRISPR文库的gRNA设计通常是优化选择high on-target和low off-target的gRNA；敲除文库通常针对5' 组成性表达的外显子，而激活和抑制文库则针对启动子或增强子区域。

虽然含有Cas9的慢病毒文库是目前最流行的CRISPR筛选方法，但它们并不适用于所有的细胞类型或实验。AAV骨架的哺乳动物CRISPR文库主要用于体内实验，逆转录病毒形式的文库可用于慢病毒转导效率差的细胞中。此外，由于技术问题，CRISPR在细菌中的应用较少，但仍有几个细菌CRISPR文库通过dCas9作用达到抑制效果。

4. CRISPR Library的设计和应用举例

在文章TSC1 and DEPDC5 regulate HIV-1 latency through the mTOR signaling pathway 中，作者为探讨调控HIV病毒潜伏的关键基因，作者首先构建HIV的荧光报告细胞（HIV-1 proviral DNA+GFP），当HIV病毒复制的时候，GFP也同时表达，因此可以通过绿色荧光来观测HIV病毒的活动情况。

在HIV-GFP报告细胞中，转入sgRNA library进行大规模基因敲除，一定时间后用FACS分选出强绿色荧光表达细胞，经过4个循环后则得到了低荧光（HIV潜伏）和高荧光（HIV活动）两组细胞，通过NGS测序发现两组细胞中的sgRNA丰度情况，经过3次重复后得到257个基因对HIV病毒活动有正向作用，最后通过数据分析筛选出TOP的gene集。后续可针对TOP基因集进行针对性的验证。

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通过这个例子，我们还可以想象，把GFP细胞换成肿瘤药耐药细胞如厄洛替尼，将FACS分选换成给药+不给药两组，一定时间后检测两组细胞的sgRNA丰度差别，则可以找到厄洛替尼耐药相关的基因。

5. CRISPR Library实验的一些心得

（1）需要注意骨架中的启动子是否适合自己的目的细胞，例如CMV启动子非常广谱，但对于人胚胎干细胞的效率则非常低，需要选用带有EF1α启动子的骨架。
（2）部分library要求细胞本身就表达Cas9，这本无可厚非，但部分细胞在高表达Cas9的情况下非常脆弱，这时候需要考虑使用inducible Cas9 system，而这个系统的构建本身就是有难度的实验，因此在设计可提前一定要做好全面分析。
（3）Library扩增工作量非常大，需要尽可能的严格按照protocol进行，并且配备质粒超大提试剂盒，部分Library要求使用特殊的感受态细胞，而该细胞之外国外出售并且非常贵。
（4）由于Library非常庞大，慢病毒的包被也是大批量的，如果使用Lipo3000或者Roche的转染试剂则花费非常大，此时可以考虑使用PEI40000等便宜且效果又好的转染试剂。
（5）此外，慢病毒的包被需要选择状态好且代数低的293T细胞，如果有293FT细胞则效果更佳。
（6）考虑筛选标记的冲突，例如目的细胞是通过慢病毒转染的方法稳定表达Cas9，且筛选标记是puromycin，那么几乎所有的Library的抗性筛选基因都是puromycin，这就冲突了。

具体更多的细节还需要我们去发现。