单细胞测序之质控分析（QC）

一、为什么要做质控？

在细胞分离过程中的细胞损伤或者文库制备的失败（无效的逆转录或者PCR扩增失败），往往会引入一些低质量的数据。这些低质量的数据的主要特点是：

• 细胞整体上的counts值少（列）
• 基因的低表达（行）
• 线粒体基因或者spike-in的比例相对较高

如果这些损伤的行或者列，没有被移除的话，可能会对下游的分析结果产生影响。所以我们在进行分析之前，一定要率先移除这些低质量的行与列。（一开始的理解，后面整个流程做完之后，或许理解会更多，那么接下来在做详细的补充）

二、质控的基本流程

1、测试数据集的加载

library(scRNAseq)
example_sce <- ZeiselBrainData()

测试数据集的基本概况（尚未做QC处理）：

class: SingleCellExperiment
dim: 20006 3005
metadata(0):
assays(1): counts
rownames(20006): Tspan12 Tshz1 … mt-Rnr1 mt-Nd4l
rowData names(1): featureType
colnames(3005): 1772071015_C02 1772071017_G12 … 1772066098_A12 1772058148_F03
colData names(10): tissue group # … level1class level2class
reducedDimNames(0):
altExpNames(2): ERCC repeat

2、质控的指标

• 每一个细胞所有基因的counts值之和

在文库制备的过程中，可能因为细胞的裂解或cDNA捕获和扩招效率的低下，而使得RNA的丢失。具有较小的counts值之和的细胞被认为是低质量的细胞，考虑被去除。

• 每一个细胞中单个基因的表达数量

多样化的转录本如果没有被成功的捕获到，因此任何一个细胞中有很少的基因表达，被认为是低质量的，考虑被去除。

• 每一个细胞中，spike-in序列/线粒体基因占总的counts值的比例

每个细胞中添加的spike-in序列（人为添加的表达量的参照系）的浓度都是等量的。如果spike-in的比值很高，那么就意味着在实验的过程中，大量的转录本丢失。

同样的，线粒体基因的高比例，也意味着这可能是由于穿孔细胞的细胞质RNA丢失，从而产生低质量的细胞。理由是，在存在适度细胞损伤的情况下，细胞膜上的孔允许单个转录物分子外排（丢失），但过小而无法使线粒体逸出，从而导致线粒体转录物的相对富集。

3、计算上述指标的值

#注释线粒体基因(常规步骤)
#这一行代码是将线粒体基因的基因名全部提取了出来，为字符型的变量,为下面的计算线粒体基因的比例做准备（同样也可以添加ERCC等subset），这里是由于这个数据集中已有ERCC的altExp了，因此不重复操作。
is.mt<-grep("^mt", rownames(example_sce),value = T)

library(scater)
#计算质量表达的矩阵
df <- perCellQCMetrics(example_sce, subsets=list(Mito=is.mt))

得到的df,是一个包含有以上各计算参数的数据框。

DataFrame with 3005 rows and 12 columns
sum detected subsets_Mito_sum subsets_Mito_detected subsets_Mito_percent

1772071015_C02 22354 4871 774 23 3.462468
1772071017_G12 22869 4712 1121 27 4.901832
1772071017_A05 32594 6055 952 27 2.920783
1772071014_B06 33525 5852 611 28 1.822521
1772067065_H06 21694 4724 164 23 0.755969
… … … … … …
1772067059_B04 5707 2250 1122 29 19.660067
1772066097_D04 2574 1441 15 13 0.582751
1772063068_D01 4993 2001 978 24 19.587422
1772066098_A12 3099 1510 203 17 6.550500
1772058148_F03 6534 1809 2074 34 31.741659
altexps_ERCC_sum altexps_ERCC_detected altexps_ERCC_percent altexps_repeat_sum

1772071015_C02 6706 43 18.0070 8181
1772071017_G12 6435 46 15.6349 11854
1772071017_A05 6335 47 11.1238 18021
1772071014_B06 7032 43 12.8999 13955
1772067065_H06 5931 39 17.1908 6876
… … … … …
1772067059_B04 5390 45 32.7799 5346
1772066097_D04 5898 43 54.6972 2311
1772063068_D01 7248 40 35.5852 8127
1772066098_A12 5072 40 50.0988 1953
1772058148_F03 4128 42 29.2807 3436
altexps_repeat_detected altexps_repeat_percent total

1772071015_C02 419 21.9677 37241
1772071017_G12 480 28.8012 41158
1772071017_A05 582 31.6435 56950
1772071014_B06 512 25.5999 54512
1772067065_H06 363 19.9299 34501
… … … …
1772067059_B04 340 32.5123 16443
1772066097_D04 163 21.4319 10783
1772063068_D01 493 39.9008 20368
1772066098_A12 169 19.2908 10124
1772058148_F03 269 24.3723 14098

我们对上述得到的这个数据库的行，列表示的值进行解释。

行名： 1772071015_C02 、1772071017_G12 、1772071017_A05 、1772071014_B06 、1772067065_H06等，为每一个测序细胞的名称。
列名：
（1）sum ：即是上文提到的，每一个细胞对应的总的counts数。
（2）detected：为满足特定阈值（基因的表达量）的基因的数目。
（3）subset_Mito_sum：为检测到的线粒体基因的counts数。
（4）subsets_Mito_detected：为满足阈值表达的线粒体基因的数目
（5）subsets_Mito_percent：线粒体基因的counts值占总counts值的比值

……ERCC、repeat的解释类似，不赘述。

将计算得到的QC的各项数值存放到SingleCellExperiment对象的colData中。

example_sce<- addPerCellQC(example_sce, subsets=list(Mito=is.mt))

查看，发现colData names变多了（由10变到22），添加成功。

example_sce
class: SingleCellExperiment
dim: 20006 3005
metadata(0):
assays(1): counts
rownames(20006): Tspan12 Tshz1 … mt-Rnr1 mt-Nd4l
rowData names(1): featureType
colnames(3005): 1772071015_C02 1772071017_G12 … 1772066098_A12 1772058148_F03
colData names(22): tissue group # … altexps_repeat_percent total
reducedDimNames(0):
altExpNames(2): ERCC repeat

4、识别低质量的细胞

（1）固定的阈值

最简单的方法就是设定一个固定的阈值，从而筛选出符合条件的细胞。（但是这种筛选的标准有时候觉得过于武断，是基于经验性的一种设定，在实际的情况下，如不同的实验体系中，阈值具有差异）
如，细胞文库大小小于100,000，基因的表达量少于5,000，spike-in的比例高于10%，线粒体基因的比例高于10%（或的关系）设定为低质量的细胞。

#low-quality
qc.lib <- df$sum < 1e5
qc.nexprs <- df$detected < 5e3
qc.spike <- df$altexps_ERCC_percent > 10
qc.mito <- df$subsets_Mito_percent > 10
discard <- qc.lib | qc.nexprs | qc.spike | qc.mito

# Summarize the number of cells removed for each reason.
DataFrame(LibSize=sum(qc.lib), NExprs=sum(qc.nexprs),
          SpikeProp=sum(qc.spike), MitoProp=sum(qc.mito), Total=sum(discard))

各类阈值下筛出的细胞数量的统计，一共筛去3005个细胞**（一共才只有3005个细胞，也就是说按照这个阈值是全筛完了）**。

DataFrame with 1 row and 5 columns
LibSize NExprs SpikeProp MitoProp Total

1 3005 2294 2686 799 3005

（2）可变的阈值

这个阈值的可变性主要体现在，是以数据本身的特征为参照，从而设定参考阈值的。
一般而言，以该组数据的中位数向着错误方向偏差超过3MADs（median absolute deviation），作为基本的参照。
使用的是isOutlier（）这个函数，低于阈值筛去，则type设定为lower；高于阈值筛去，则type设定为upper。

qc.lib2 <- isOutlier(df$sum, log=TRUE, type="lower")
qc.nexprs2 <- isOutlier(df$detected, log=TRUE, type="lower")
qc.spike2 <- isOutlier(df$altexps_ERCC_percent, type="higher")
qc.mito2 <- isOutlier(df$subsets_Mito_percent, type="higher")
#查看阈值
attr(qc.lib2, "thresholds")
attr(qc.nexprs2, "thresholds")
attr(qc.spike2, "thresholds")
attr(qc.mito2, "thresholds")
discard2 <- qc.lib2 | qc.nexprs2 | qc.spike2 | qc.mito2
DataFrame(LibSize=sum(qc.lib2), NExprs=sum(qc.nexprs2),
          SpikeProp=sum(qc.spike2), MitoProp=sum(qc.mito2), Total=sum(discard2))

各类阈值下筛出的细胞数量的统计，一共筛去189个细胞 （可以看到与前面的固定阈值的筛选结果相比，筛去的细胞的数量大大减少）。

DataFrame with 1 row and 5 columns
LibSize NExprs SpikeProp MitoProp Total

1 0 3 65 128 189

需要注意的是，可变阈值这样的一种筛选方式是基于一定的假设条件的。

基本假设： a.大多数细胞的质量都是好的。
b.QC指标（即上文提到的sums,detected等等），与生物学的实验条件无关，是系统变量。

在一些特殊的生物体系之中，这些“假设”会不成立。
比如一个细胞群系中的细胞的异质性程度很高，存在一些细胞天生的RNA的表达量很少，或者线粒体基因的相对比值很高。那么这一部分细胞就很容易在处理的过程中，当做是低质量的细胞，被去除。

（3）批次效应的影响

批次效应在处理数据的过程中需要被考虑到。那么，怎么去鉴定一个数据集是否存在批次效应呢？

attr(discard.ercc2,“thresholds”)
D10 D17 D2 D3 D7
lower -Inf -Inf -Inf -Inf -Inf
higher 9.475052 7.599947 6.010975 9.475052 15.21696

#每一个批次，他的阈值是不一样的#考虑到不同的批次
attr(discard.ercc,“thresholds”)
D10 D17 D2 D3 D7
lower -Inf -Inf -Inf -Inf -Inf
higher 73.6107 7.599947 6.010975 113.1058 15.21696