衡量基因相对表达量的RPKM、FPKM、TPM详解

衡量基因相对表达量的RPKM和FPKM、及TPM

1.RPKM（Reads Per Kilobase per Million）和FPKM（Fragments Per Kilobase per Million）

1.引入“每一千碱基（per kilobase）”的原因在于，不同的RNA可能有不同长度，长度越长，对应的reads就越多。当每个RNA都除以自身长度（以1000碱基,即kb为单位）时，就可以比较同一个样本中不同基因的相对表达量了。
2.引入“每一百万reads”的原因是，不同的样本可能测序的深度不一样，深度越深，当然对应的reads就越多了。如果结果除以各自库的数量（以一百万reads为单位），那么我们就能很好地衡量两个不同样本中同一个基因的相对表达量。

计算方法

第一步先将测序深度标准化，计算方法很简单，先分别计算出每个样本的总reads数，然后将表中数据分别除以总reads数即可，这样就得到了reads per million。

第二步是基因长度的标准化。将第一步的read per million直接除以基因长度即可。

FPKM和RPKM的定义是相同的，唯一的区别是FPKM适用于双端测序文库，而RPKM适用于单端测序文库。是衡量基因相对表达量的一个公式，

RPKM是将Map到基因的Reads数除以Map到Genome的所有Read数(以Million为单位)与RNA的长度(以KB为单位)，是衡量基因相对表达量的一个公式，适用于单端测序

FPKM是将Map到基因的Fragments数除以Map到Genome的所有Read数(以Million为单位)与RNA的长度(以KB为单位)。适用于单端和双端测序。
它们2者的不同：
在single-end（单端测序）测序中，FPKM将read当做fragment计算，此时FPKM和RPKM是相同的。
而在pair-end（双端测序）测序 中， 若一堆paired-read 都比对上了，当做一个fragment。

TPM：Transcripts Per Kilobase per Million mapped reads (每千个碱基的转录每百万映射读取的Transcripts)：它先对每个基因的read数用基因的长度进行校正，之后再用校正后的这个基因read数(nr/Lr)与校正后的这个样本的所有校正后的read数（sum( nr/Lr+………+ nm/Lm )）求商，是衡量基因相对表达量的一个手段
TPM的出现：
TPM的不同在于它的处理顺序是不同的。即先考虑基因长度，再考虑测序深度。
它的好处是，上边FPKM：
FPKM = (10^6 * nf) / （L * N）
其中：
nf 代表比对至目标基因的fragment数量；
L代表目标基因的外显子长度之和除以1000，单位是Kb；
N是总的有效比对至基因组的fragment数量。
FPKM中N同样会受到各个转录基因长度（distribution of transcript lengths）的影响，也就是说：FPKM/RPKM是不准确的。而TPM在一个样本中一个基因的TPM：先对每个基因的read数用基因的长度进行校正，之后再用校正后的这个基因read数(nr/Lr)与校正后的这个样本的所有校正后的read数（sum( nr/Lr+………+ nm/Lm )）求商。TPM除以经过基因长度归一化后的有效比对的read总数，即归一化后的测序深度。
————————————————

杨梦磊
20211024