Hi,大家好。最近在帮师姐分析甲基化，顺便就把甲基化分析过程整理一下。
我们先来看看什么是DNA甲基化。
DNA甲基化（DNA methylation）为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。所谓DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5号碳位共价键结合一个甲基基团。大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达[2]。
在成熟体细胞组织中，DNA甲基化一般发生于CpG双核苷酸（CpG dinucleotide）部位；而非CpG甲基化则于胚胎干细胞中较为常见[1，2]。植物体内胞嘧啶的甲基化则可分为对称的CpG（或CpNpG），或是不对称的CpNpNp形式（C与G是碱基；p是磷酸根；N指的是任意的核苷酸）。DNA甲基化可以理解为基因组上的表观修饰，也就是说甲基化可以导致基因失活，去甲基化则代表基因的激活与表达。
从公司拿到DNA甲基化测序数据后，我们就可以进行DNA甲基化分析了。
DNA甲基化数据处理所使用的软件为Bismark（https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/bismark/）.
依赖软件
需要用户提前安装好Bowtie2(http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml)和Hisat2(https://ccb.jhu.edu/software/hisat2/index.shtml),bam文件输出需要提前安装Samtools(http://samtools.sourceforge.net/)
一、下载软件
我们可以从官网直接下载，也可以从GitHut（https://github.com/FelixKrueger/Bismark）下载
下载好，进入Bismark
git clone https://github.com/FelixKrueger/Bismark.git
cd Bismark
./bismark_genome_preparation –version
接下来分析，我们使用软件中的示例文件,在travis_files文件中
cd travis_files
ls
二、对基因组构建索引
/bismark/bismark_genome_preparation --path_to_aligner /usr/bin/bowtie2/ --verbose /data/travis_files
结果生成Bisulfite_Genome文件夹,使用tree命令查看文件夹下都有什么文件
三、运行bismark, 进行比对
对于双端测序
bismark --genome ./travis_files/ -1 ./travis_files/test_R1.fastq.gz -2 ./travis_files/test_R2.fastq.gz -p 2 -o ./results/
这里将输出两个文件:
- test_R1_bismark_bt2_pe.bam (contains all alignments plus methylation call strings)
- test_R1_bismark_bt2_PE_report.txt (contains alignment and methylation summary)
四、删除重复数据
./deduplicate_bismark --bam ./results/test_R1_bismark_bt2_pe.bam --output_dir ./results/
五、提取甲基化位点
./bismark_methylation_extractor -p --gzip --bedGraph --buffer_size 10G --cytosine_report --comprehensive --genome_folder ./travis_files/ ./results/test_R1_bismark_bt2_pe.bam -o ./results/
--cytosine_report生成基因组中所有cytosine的全基因组甲基化报告。
--comprehensive会合并正反链的数据，输出CpG/CHG/CHH三种类型的甲基化文件，包含了胞嘧啶所有的组合形式，但我们最关注的是CpG位点的甲基化。
六、生成处理报告和总结报告
./bismark2report
./bismark2summary
结果解析
bismark2report此脚本使用Bismark比对报告来生成图形HTML报告页。
即test_R1_bismark_bt2_PE_report.html, 它包括了比对信息，甲基化信息，M-bias等，我们可以简单看一下
前面已经提到使用--comprehensive，会输出CpG/CHG/CHH三种类型的甲基化文件，其中CpG_context_test_R1_bismark_bt2_pe.txt.gz即为CpG甲基化位点的文件。
less CpG_context_test_R1_bismark_bt2_pe.txt.gz
文件中每一列含义
第一列是测序信息
第二列为甲基化状态，+为甲基化，-为为甲基化
第三列为染色体
第四列为起始位置（等于终止位置）
第五列为methylation call strings, 即大写就是甲基化
-
z- C in CpG context - unmethylated -
Z- C in CpG context - methylated -
x- C in CHG context - unmethylated -
X- C in CHG context - methylated -
h- C in CHH context - unmethylated -
H- C in CHH context - methylated -
u- C in Unknown context (CN or CHN) - unmethylated -
U- C in Unknown context (CN or CHN) - methylated -
.- not a C or irrelevant position
test_R1_bismark_bt2_pe.bismark.cov.gz提供了每个位点的甲基化比例
less test_R1_bismark_bt2_pe.bismark.cov.gz
第一列为染色体
第二列为起始位置
第三列为终止位置
第四列为甲基化比例
第五列为甲基化个数
第六列为未甲基化个数
如何你还有其他问题，可以直接看软件里面README.md,也可以咨询我。
参考：
1.Dodge, Jonathan E.; Bernard H. Ramsahoyeb, Z. Galen Woa, Masaki Okanoa, En Li. De novo methylation of MMLV provirus in embryonic stem cells: CpG versus non-CpG methylation. Science Direct. May 2002 [2007-06-23].
2.百度百科
- DNA甲基化测序数据处理（一）：数据比对https://www.jianshu.com/p/5d7e550abc1a?from=singlemessage