sgRNA切割活性问题探讨

基因编辑需要通过网站设计合适的sgRNA，确认切割效率之后既可以进行细胞实验或者活体注射，下面讲述几点关于sgRNA活性检测中遇到的问题及思考。

虽然体外的剪切活性并不能模拟体内真实的情况，也有报道的sgRNA并未经过筛选直接进行注射后突变检测。但是，体外的检测在一定程度上还是可以缩小候选sgRNA，提高突变的效率。并且市面上的各种包装的产品也有这一流程，所以综合来讲还是可以作为评价的标准的。

整个制备sgRNA过程包含以下几个步骤：

1. sgRNA模板制备：

成分	含量
sgRNA_foward primer(10uM)	6.25 ul
scaffold primer(10uM)	6.25 ul
2x PCR master mix	12.5 ul

反应条件：
Standard PCR conditions were as follows: denaturation at 94 °C for 3 min, followed by 30 cycles of denaturation at 94 °C for 30 s,annealing at 55 °C for 30 s and extension at 72 °C for 30 s, with a final extension at 72 °C for 10 min.
Zheng, W., et al. (2019). "Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated 9-mediated mutagenesis of the multiple edematous wings gene induces muscle weakness and flightlessness in Bactrocera dorsalis (Diptera: Tephritidae)." Insect Mol Biol 28(2): 222-234.

该反应不存在指数扩增的过程。
产物纯化回收用于转录模板；

2. sgRNA转录：

成分	含量
DNA template	1000 ng
2 * T7 Reaction buffer	10 ul
T7 Enzyme	2 ul
H2O	up to 20 ul

37℃或42℃孵育2h
添加DNase 37℃孵育30min去除模板DNA

3. sgRNA产物纯化

产物纯化参考试剂盒说明书，或者参考MEGAclear™ 转录纯化试剂盒替代方案

4. 体外活性检测：

通过cas9酶切检测：

成分	含量
DNA	400-600ng
10*Buffer	1ul
sgRNA	200ng - 500ng
cas 9 protein(1000ng/ul)	0.5ul
H2O	up to 10ul

37℃ PCR仪孵育1h
添加loading buffer后进行琼脂糖凝胶电泳（切勿含SDS)。

影响sgRNA活性因素：

理论上，产生的sgRNA为单链RNA序列，不同的方法并不会对切割活性造成显著的影响，然而根据笔者的经验，情况要比想象的更为复杂。以下罗列出影响sgRNA活性的因素，但是并没有系统性的研究支撑，所以仅供参考。

1. sgRNA核酸序列决定了sgRNA是否具有切割活性；
   不同核酸序列特异性识别效率不同。

2. sgRNA转录产物纯化质量决定切割效率；
   用Thermo fisher纯化试剂盒和Aidlab试剂盒回收产物，切割效率不同。

3. DNA模板片段长度，影响sgRNA切割效率；
   通过对800bp和500bp长度用相同sgRNA切割，结果显示不同的切割效率不等。

4. T7转录效率决定切割效率；
   T7转录时加入1500ngDNA模板，转录后的sgRNA结果显示活性较好。

5. 不同DNA模板质量对后续sgRNA活性有影响。
   用过柱纯化获得的sgRNA和磁珠法回收的sgRNA对后续切割效率有影响。

几种影响活性的推断：

sgRNA转录后，不同纯化方式影响了其二级结构，使得识别DNA片段有所影响，才导致切割产生差异。同理，DNA长度不同，存在复杂的二级结构，或者隐匿了识别的位点，造成切割上的差异。

所以，在进行sgRNA初步功能筛选时候，如果切割活性不佳，并不能武断地下结论定性，而是尝试优化实验过程中的诸多影响条件，再次验证切割活性。或者更换不同试剂，不同引物合成公司、间隔一定时日再次从新实验等方法来确认切割效率。