2021-11-07

Nat Cell Bio丨药物调节免疫治疗靶点的表达，克服耐药性

原创 珍奇 图灵基因 今天

收录于话题#前沿分子生物学机制

撰文：珍奇

IF：28.82

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亮点：

本研究使用单细胞转录组和染色质可及性概况来定义作为恶性浆细胞细胞状态转变基础的转录和顺式调节改变；在不同细胞状态的建立过程中推断基因调控网络 (GRN) 配置，并强调驱动表型变化的调控因素；这些表型变化也为克服耐药性的靶向治疗策略提供了基本原理。

在以往研究中，有大量证据表明遗传变异是治疗抗性的基础，但事实上其他变异来源是由细胞可塑性引起的。2021年10月19日，《Nature Cell Biology》杂志上发表了一篇名为“Dynamic transcriptional reprogramming leads to immunotherapeutic vulnerabilities in myeloma”的研究性论文，本文以多发性骨髓瘤为例展示了癌细胞如何通过调节谱系限制、调整其增强子的使用并利用细胞内在多样性来持续生存和逃避治疗的。本研究还阐明了治疗可产生如CXCR4的免疫治疗靶点用于克服治疗耐药性，并描绘了将构成耐药性基础的细胞可塑性转化为免疫肿瘤治疗机会的可能性。

尽管大多数癌症患者对初始治疗有反应，但由于耐药性的发生治疗反应通常十分短暂。非遗传细胞可塑性和适应性状态变化最近已成为癌症治疗耐药性的基础，更好地了解细胞状态转变的调控方式对于开发可克服耐药性的治疗方法至关重要。这些转变由动态转录变化介导，可能涉及开放染色质景观的表观遗传重塑或转录调节因子活性的变化。

为了在单细胞水平上研究谱系失真性（lineage infidelity）和耐药性，本文研究了多发性骨髓瘤 (MM)，这是一种骨髓中产生抗体的浆细胞的恶性肿瘤。浆细胞是终末分化细胞的观点长期以来阻碍了对 MM 表型可塑性和分化的深入研究。然而，最近已经证明正常和恶性浆细胞的分化状态不同。此外，有人提出不成熟的状态可能与耐药性相关。然而，目前尚不清楚异质分化状态如何在转录和表观遗传水平上受到调节，以及它们是否会随着治疗而改变。

为了以单细胞分辨率定义骨髓瘤中的转录状态，他们使用 SmartSeq2对骨髓瘤细胞和来自八个骨髓或血液的 CD45+ 免疫细胞进行全长单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）。其中簇 20、1、5、7、14、12、3 和 13 对应于 CD4+ 和 CD8+ T 细胞、NK 细胞、B分别为细胞、单核细胞和中性粒细胞，而簇 2、4、6、8、10、11、15、16、17和 19 被标注为浆细胞。这与临床细胞遗传学的结果高度一致。随后，他们采用随机森林（RF）模型来确定最能区分假定恶性细胞和正常浆细胞的基因。 RF 模型确定了几个先前被描述为 MM 驱动因素的基因，使用将骨髓瘤特异性基因表达与拷贝数和克隆型分析相结合的聚合方法，他们能够有力地将骨髓瘤细胞与正常浆细胞区分开。通过标记基因分析对恶性簇进行表征确定了已知的骨髓瘤驱动基因，有趣的是，一些驱动基因在不止一个 MM 簇中高度表达。他们确实观察到具有 CCND1 易位的个体表达了相应的CD1 特征，但进一步表现出其他特征的不同表达。研究者在每个个体的相同单细胞中检测到不相关特征的共表达，这表明存在广泛的转录差异，但没有被既定的基因表达分类器捕获。

为了更详细地研究转录异质性，他们首先评估了细胞周期作为异质性潜在来源的影响。他们除了簇 10没有观察到细胞周期驱动对 PAGODA2 聚类的影响。随后，他们接下来对反映 22 种癌症类型的 198 个细胞系中鉴定的 11 个复发性异质性程序的表达进行了评分。这些代表不同生物过程的程序，包括细胞周期、应激反应和蛋白质成熟，揭示了患者间和患者内广泛的异质性。为了识别显示骨髓瘤细胞变异性的其他细胞状态，他们采用非负矩阵分解来识别他们数据集中的表达程序。多种细胞信号的表达特征评分揭示了患者之间和患者内部已识别表达程序中广泛的转录变异性。

他们接下来试图定义在单个癌细胞中共同表达的转录谱的性质。为了研究骨髓瘤细胞是否从不太成熟或完全不同的造血谱系获得转录状态，他们定义了源自 BLUEPRINT 数据集的表达特征，发现骨髓瘤细胞的转录状态确实从正常浆细胞向更不成熟的淋巴祖细胞群或完全不同的造血前体细胞分化。为了捕捉不同发育阶段之间的分化轨迹，他们根据祖细胞特征的表达进行了聚类分析，并进行了 RNA 速度分析。他们确定了从较少分化细胞到较多分化细胞的分化轨迹。有趣的是，他们观察到分化轨迹的起点和终点与不同的信号状态相关，特征是 MAPK 途径或 PI3K 途径的相互排斥激活。虽然在循环和未成熟细胞的亚群中检测到 MAPK 活性，但更成熟的细胞显示出 PI3K 的激活，表明 PI3K活性诱导 PRDM1 和 B 细胞的终末分化。这些发现表明 MM 细胞沿两种不同状态排列，其特征是分化状态和信号活动的异质性。

GRN 在调节细胞命运中发挥关键作用，为了识别 MM 中特定于状态的 GRN，他们接下来构建了一个基于 MM 细胞调节子活动的网络。有趣的是，虽然大多数调节子在健康造血细胞和骨髓瘤细胞中具有活性，但他们发现许多调节子在正常造血中基本上不活跃或完全不存在。因此，他们确定了具有最高重新布线分数的 TF，其中转录调节因子和靶基因之间的连接发生了改变。接下来他们确定了可能代表潜在治疗靶点的顶部重新布线的细胞表面标志物。数据表明，尽管定义浆细胞谱系的 TF 的表达得以保留，但骨髓瘤细胞中仍会发生大量转录重新布线，并且表面蛋白的错误表达似乎是这种重新布线的重要后果。

为了评估转录多样性的增加是否可归因于染色质的可及性更高，他们对来自一部分患者以及健康供体浆细胞的骨髓瘤细胞进行了单细胞 ATAC 测序（scATAC-seq）。数据表明 MM 中异染色质的去抑制允许 TF 的结合和该谱系中通常不表达的基因表达，最终导致替代细胞状态的混杂。

他们接下来研究了发育潜力是否随着治疗而改变。CytoTRACE 值在处理后降低，这表明处理降低了发育潜力和转录多样性。因此，他们假设治疗可能会调节 TF 活性。值得注意的是，治疗后整体调节子活性增加，活性增加的调节子包括 B 细胞 TF FOXO3 和浆细胞命运 IRF4 和 PRDM1 的调节子，而下调的调节子包括重新连接的非谱系 TFs ELF3 和 TEAD4。随后他们在体外模拟了短期药物治疗，以研究是否通过治疗选择了调节子活性增加的细胞，或者治疗是否直接诱导了这些转录变化。结果显示治疗导致发育潜力降低，这表明这种变化是治疗的直接影响而不是选择的影响。他们假设调节子活性的变化可归因于染色质可及性的差异，因此他们在 PVD 处理 72 小时后对 MM 细胞系（MMCL）MOLP2 进行了 ATAC-seq。 DESeq2 的差异可及性分析表明处理引起染色质可及性的显着变化。结果表明治疗直接调节转录景观。

确定了 MM 中表面标志物的失调表达，他们假设这些可能代表有吸引力的治疗靶点，因为表面标志物很容易获得并且可以被免疫疗法靶向。CXCR4 因参与 MM 在疾病进展中发挥作用并诱导上皮和间质过渡（EMT）样表型而牵连到 MM 中。因此，CXCR4代表一个有吸引力的治疗靶点，特别是因为CXCR4拮抗剂已经在临床试验中测试复发性骨髓瘤。实验结果表明，药物治疗确实可以调节表面标记表达，并可以诱导潜在治疗靶点的表达。

教授介绍

Jens G. Lohr，哈佛医学院布里格姆妇女医院助理教授、达纳-法伯癌症研究所医学肿瘤学助理教授。其实验室主要研究多种癌症的进化和耐药性，特别是多发性骨髓瘤。他们使用"液体活检"方法获取循环肿瘤细胞（CTCs）和无细胞DNA（cfDNA），结合创新的DNA和RNA测序技术和计算分析，作为深入了解肿瘤生物学并将这些发现转化为新靶向疗法的工具。这些方法可随着时间的推移更深入地了解癌症的动态分子和基因变化。

参考文献

Frede, J., Anand, P., Sotudeh, N.et al.Dynamictranscriptional reprogramming leads to immunotherapeutic vulnerabilities inmyeloma.Nat Cell Biol(2021). https://doi.org/10.1038/s41556-021-00766-y