今天给大家介绍一篇2020年9月3号在cell上发表的一篇单细胞的文章，“Therapy-Induced Evolution of Human Lung Cancer Revealed by Single-Cell RNA Sequencing”。
首先，给大家介绍下这篇文章的最后一位通讯作者，Trever G.Bivona, MD,PhD. 他来自美国加州大学旧金山分校的MD和PhD，他是一个具有细胞和分子生物学PHD学位的医学肿瘤学家。他具有丰富的学术临床经验并且领导着一个基础和转化研究实验室，这个实验室的主要研究癌症基因组，精准医疗，靶向治疗反应和抗药的分子基础。 他在肺癌和其他癌症中发现了几个抗药的机制，EGFR 靶向治疗，BRAF和MEK靶向治疗以及ALK靶向治疗。 他指导多个组织的团队参与实验室基础的聚焦于病人的研究，并且是临床试验的研究者，包括前期是预防的理性的综合实验，并且消除了抗药性，并且被实验室基于的发现所驱动。
这位医生的教育经历：
1 范德堡大学 ，BS，1998年 分子生物学位
2 纽约大学 ，医学院， PHD， 2004， 细胞和分子生物学
3 纽约大学 ， 医学院， MD， 2005， 医学
4 布里格姆妇女医院/哈佛，2005-2007，内科
5 纪念斯隆-凯特琳癌症中心，2007-2011，医学肿瘤学
目前这位医生在cell，science， nature commujnication， JTO上发表了多篇文献。
In Brief
通过分析靶向治疗前后的肺癌转移灶揭露了可以调整临床结果的分子和免疫的适应性。
Highlights：
1 单细胞RNA-seq在人类的非小细胞肺癌中是可行的，并且揭露了一个丰富的肿瘤生态系统。
2 个体肿瘤和癌症细胞显示了连续的分子多样性。
3 癌症和肿瘤的微环境展示了明显的治疗诱导的可塑性。
4 转移灶的非小细胞肺癌的单细胞RNA-seq数据揭露了新的提高临床反应成果的新的机遇。
summary：
肺癌，癌症致死率的头号原因，展示的异质性限制了治疗的成功，但是却依然没有完全的被人理解。在这篇文章中，对来自30个病人的靶向治疗前后的49个临床活检样本做了单细胞RNA-seq测序。超过20,000个癌症和肿瘤微环境的单细胞文件展示了一个丰富的和动态的肿瘤生态系统。 通过肿瘤单细胞RNA-seq找到了靶向的致癌基因除了可以在临床上检测到的。癌症细胞幸存治疗随着剩余的疾病表达了一个肺泡再生细胞信号提示治疗诱导的原始细胞状态转变，而那些治疗进展性疾病(PD)的患者则上调了犬尿酸、纤溶酶原和间隙连接通路。 激活的T淋巴细胞和降低的巨噬细胞在RD和免疫抑制的细胞状态特征的PD中呈现。通过单细胞RNA-seq所揭露的生物学功能是临床表现的生物标志物在独立的cohorts。这个研究阐明了这个转移癌的多细胞的生态系统的治疗诱导的适应性是如何影响临床成果的。
Introduction：
异质性是很多生物系统和疾病比如说癌症的特性。癌症细胞的生物的可塑性是异质性的一种形式允许早期适应治疗，并且限制了癌症治疗精准治疗的成功。 除了癌症细胞内在的异质性，肿瘤微环境中的细胞更以肿瘤内在的方式贡献了肿瘤的异质性，然而这些肿瘤的成分和异质性已经在很多癌症类型里面被很好的研究。关于我们理解这些特性是如何进化以及在长度上相互联系的理解还是很不完全，尤其是在转移的肿瘤中。
很多癌基因驱动的癌症，比如说那些在EGFR，ALK，ROS1和BRAF上发生改变的癌症通过靶向治疗抵抗癌蛋白，这种方法大大提高了肺癌，黑色素瘤以及肝癌的转移瘤的临床成果，然而肿瘤反应并不是很完全，而且如果产生抗药性就会很容易再次生长。肿瘤组织经过靶向治疗已经鉴定出了抗药机制，并且证明了随着治疗的进行，肿瘤会变的具有增长的异质性。
单细胞RNAseq是检测复杂生物系统异质性的方法之一，目前比较少的单细胞的研究研究样本的转移灶，而且大部分专注在单次治疗。 这个关键问题在于获得高质量的转移灶样本比较难，尤其是多个治疗时间点取样。
通过开发一个常规的pipeline，他们做了单细胞RNA-seq的分析对晚期的NSCLC样本，这些样本来自没有经过系统靶向治疗（TKI）的的病人， 在residual disease（RD）state， 包括在靶向治疗期间，当临床成像(RD)显示肿瘤退行或稳定时，以及在临床成像确定的后续进展中，肿瘤表现出获得性耐药时采集的样本(进展[PD])。
Results
1 scRNA-seq Analysis of Advanced-Stage NSCLCs during Targeted Therapy
（对靶向治疗期间晚期的NSCLCs进行单细胞RNAseq 测序）
他们利用单细胞RNA-seq测序去探测49个样本（45个肺腺癌，1个鳞癌样本和3个肿瘤相邻的组织）（Figure1A），对应了30个病人。他们用了一个常规的workflow去分离来自手术切割和小组织样本的鲜活的单细胞悬液（Figure1B）。样本被分成3个独立的时间点（TN，RD，PD）并且更进一步的按照致癌因素细分（Figure1C）。RD样本的收集时间在FigureS1A中被阐明（FigureS1A）。额外的样本情况和病人的统计资料在TableS1中可以看到。
23，261个细胞的基因表达文件被保留通过质量控制的过滤后，通过对基因表达的标准化，他们做了PCA分析并且用graph-based clustering 方法给富有信息的PCA结果进行聚类。 这些分类的结果被注释成免疫，基地细胞（纤维，内皮细胞和黑色素细胞）以及上皮细胞通过marker基因（Figure1D）。 上皮细胞（n=5,581）被取子集然后再次聚类成了26个分散的上皮clusters（ FigureS1B）。每种细胞类型的细胞数每个样本做了什么分析在TableS1中被列了出来。
2 Clustering-Based Copy-Number Variation Resolves Cancer from Non-cancer Epithelial Cells
（通过对拷贝数变量进行聚类揭露了从非癌上皮细胞进化出癌症）
考虑到癌症和大规模染色体变化之间的相关性，他们用来自于RNA表达量推出来的拷贝数去对上皮细胞进行分类，分成癌症和非癌症； 同纤维细胞和内皮细胞比较，肿瘤细胞展示了较大的改变在整个基因组表达上（FigureS1C）。三个TAT样本被纳入到这个分析中，来源于这些样本的大部分细胞被认为是非癌细胞。他们比较在不同治疗时间点，这些样本的平均的CNV得分。 这些非癌上皮细胞的clusters被进一步注释成不同的细胞类型（FigureS1D和S1E）。
和其他人发现的一样，他们发现癌症细胞表达了更多的基因相比较非癌细胞，这种在基因数量上的差异并没有被测序深度解释。
49个原始肿瘤活检样本中有44个发现了癌细胞，包括一小部分来自于每个TAT样本的细胞(占TAT获得细胞总数的0.57% - 1.8%)。鉴于TAT细胞可能代表了正常细胞和癌细胞之间的一种中间细胞状态，它们出现在低频率并不令人惊讶，而且之前已经描述过了。
所有癌细胞(n = 3754)重新聚集，形成25个独特的簇(图S2A和S2B)。对于25个集群中的每一个，我们计算了非癌症和癌症上皮细胞集群中贡献最大的单个患者的细胞数量(患者占用率)(图S2C S2E)。大多数肿瘤细胞簇是病人特异的，具有较高的病人occupancy 得分，同之前的报道相符。(Chung et al.， 2017;Darmanis等人，2017年;Jerby-Arnon等人，2018;Neftel等人，2019年;Puram等人，2017年;Tirosh等，2016)。相反，非癌细胞类型表现出较低的病人占用率(图S2E)。因此，患者特异性的恶性细胞聚集反映了单个患者肿瘤的独特分子特征，而不是技术错误。
3 scRNA-seq Analysis Reveals a Rich Complexity of Expressed Gene Alterations in Cancer Cells
（单细胞RNA seq分析揭示了在癌症细胞中一个丰富的关于表达基因变化的丰富的复杂性）
额外的基因组的变化可以和主要的靶向致癌的“driver ”变化共存，可以帮助促进肿瘤的形成以及限制靶向治疗。他们提取了每个癌症细胞的单细胞RNA-seq转录组的数据去找体细胞突变。 49个活检样本里面有44个包含肿瘤细胞， 他们发现有20个样本具有临床上已知的致癌driver 基因。这个比例和潜在的drop-out发生率是一致的，在单细胞RNA seq分析。 在24个样本里，我们并没有找出临床已知的致癌driver，没有细胞表达感兴趣的基因，在我们没有识别出临床上已知的致癌驱动的24个样本中，没有细胞表达感兴趣的基因，因此不允许对该基因进行突变检测(图S2H;表S3)。在20个样本中的11个样本(55%)中，我们确定了临床可操作的致癌基因，我们还确定了在对同一患者肿瘤的临床级批量核酸检测中未检测到的另一种致癌改变(即隐匿性基因改变)(图2B;图S2H)。示例LTS47就是一个例子。经临床级大块DNA分析，该肿瘤存在EML4-ALK致癌基因重排。另外，scRNA-seq还显示，该样本含有KRAS G13D和KRAS G12C隐匿突变的癌细胞(图S2F)。考虑到scRNA-seq数据中可能存在的遗漏，我们不能断定ALK融合和KRAS突变是否共存于同一细胞内。然而，KRAS突变体细胞中没有显示ALK基因重排的迹象，该样本是患者在接受多种治疗后获得的，这可能导致了多种耐药机制的进化(Doebele et al.， 2012;Hrustanovic和Bivona, 2015年;(Shaw and Engelman, 2013)。致瘤驱动程序的丢失也是耐药性的一种机制(Lovly et al.， 2017;Tabara等人，2012;Xu et al.， 2018a)，尽管考虑到scRNA-seq的局限性，我们不能确定这种耐药机制是否适用于本案例。
我们还查询了来自COSMIC(癌症体细胞突变目录)肺腺癌第1级突变的scRNA-seq数据(表S2)，(福布斯等人，2017;Shihab等，2015)。尽管我们发现的许多突变已经包括在临床小组中，但在对患者肿瘤进行的临床级分析中并没有报道过(图2C;图S2I;表S2和S3)。虽然这可能反映了临床检测时活检技术或肿瘤克隆性的差异，但这些结果也表明，临床级批量dna检测可能低估了肿瘤的异质性，为了评估存在多种致瘤改变的患者的临床结果，并确定我们的研究结果更广泛的转化影响，我们使用了NSCLC数据集(Zehir等，2017)。那些在scRNA-seq分析中检测到的1级宇宙突变集(高突变)中肿瘤显示大于或等于2个突变的患者，与那些肿瘤显示小于2个宇宙1级突变的患者相比，其总体生存(OS)显著降低(突变低)(p <0.01;图S2J)。因此，scRNA-seq分析可以增加对癌细胞基因组异质性的分析粒度，并提供对转录表示的突变景观的洞察。
4 Transcriptional Differences between TN and RD Cancer Cells Detected by scRNA-Seq Analysis Reveal CellState-Specific Biological Programs
（在TN和RD癌症细胞之间转录组的差异通过单细胞RNA-seq分析揭示了细胞状态特异的生物过程）
我们假设，定义在治疗反应期间癌细胞中激活的生物程序，可以识别在初始治疗期间促进包括RD的癌细胞适应和生存的信号通路。我们比较了从TN到RD的肿瘤样本中获得的单个癌细胞的转录谱(表S4)，并显著关注了629个(p <0.05) RD癌细胞中上调的基因作为途径激活的替代证据。我们发现了许多与癌症相关途径相关的基因(表S5)。重要的是，我们发现，与TN和PD相比，RD癌细胞表达的增殖标记基因减少，这与预期一致，即在靶向治疗期间，持续存在的癌细胞通常增殖较少(图S3A) (Hsiao et al.， 2019)。
有趣的是，我们鉴定了由17个已建立的肺泡细胞基因标记组成的肺泡细胞基因表达签名(Vieira Braga et al.， 2019;(Wade et al.， 2006)，显示RD时间点与TN时间点的表达显著增加(p <0.0001;图3;图S3B;表S2)。肺泡细胞由肺泡1型(AT1)和肺泡2型(AT2)亚型组成，构成肺泡的内衬。AT2细胞可产生表面活性剂，并可作为干细胞样祖细胞，在各种类型的肺损伤中变得活跃并增殖，被怀疑是癌基因驱动肺癌的细胞来源(Desai et al.， 2014;Hanna和Onaitis, 2013年;Nabhan等，2018年)。AT1细胞是肺泡中的优势细胞群，介导气体交换，在受伤或死亡时，可释放增殖和再生信号(Desai et al.， 2014)。AT1细胞包括HOPX+ /IGFBP2+和HOPX+ /IGFBP2两种群体亚型，其中HOPX+ /IGFBP2代表保持细胞可塑性、可增殖并转分化为AT2细胞，使损伤后组织再生的细胞群体(Wang et al.， 2018)。我们在RD处检测到的癌细胞的肺泡特征包括AT1和AT2相关基因(表S2)，包括AT2细胞的AQP4、SFTPB/C/D、CLDN18、FOXA2、NKX2-1和PGC (Desai et al.， 2014;Liu等，2003;Nabhan等人，2018年;Wade等人，2006年;Xu et al.， 2016;和AGER、HOPX和IGFBP2对AT1细胞的作用(Nabhan et al.， 2018;Serveaux-Dancer等，2019年;图S3B)。此外，我们在癌细胞中鉴定的肺泡细胞状态并不是来自我们的癌细胞群中注释错误的非癌症肺泡细胞(图S3C)。
我们用正交方法验证RD时肺泡细胞特征的激活。首先，我们使用由患者衍生的EGFR突变NSCLCs (PC9)组成的临床前模型(Lee et al.， 1985)开发TN、RD和PD临床状态的类似物。利用RT-PCR，我们检测了RD临床样本中显著上调的肺泡细胞标志基因NKX2-1的表达，并发现NKX2-1的表达显著升高(p <与对照组和获得性耐药细胞相比，维持状态细胞的表达情况(图3B)。这表明从临床scRNA-seq分析中识别的肺泡特征可以在体外受控条件下复制。此外，免疫组织化学(IHC)分析显示，在血浆中可诱导AQP4蛋白表达，AQP4是肺泡细胞特征的另一标志物RD临床标本与TN和PD临床标本的膜比较(图3C;图S3D)。
我们在TCGA肺腺癌大块RNA-seq数据集(https://www.cancer.gov/about-nci /organization/ccg/research/structural-genomics/ TCGA, Cancer Genome Atlas research et al.， 2013)中检测肺泡特征是否为患者生存的临床相关生物标志物。我们发现一个显著的(p <0.0001)与低肺泡表达特征的患者相比，这些肿瘤中我们的肺泡特征高表达与患者OS改善之间的关系(图3D;表S6)。
这些发现支持了RD癌细胞有明显的肺泡基因表达特征的论断，并与改善患者生存率相关。一种可能的模型是，RD癌细胞中激活的识别的肺泡特征反映了细胞损伤和修复特征，使人联想到非癌性AT1和AT2细胞(Nabhan et al.， 2018;Wang等，2018)。这一特征的表达增加可导致治疗期间细胞死亡的修复和逃避，以支持癌细胞的持久性，同时构成一个较低的侵略性恶性状态。这与RD代表了在临床前模型中观察到的存活但不快速增殖的缓慢循环癌细胞的一种永久细胞状态的观点相一致(如图S3A所示)，它是绝对耐药导致侵袭性肿瘤进展的先兆(Hata et al.， 2016)。
肺泡的分子细节和细胞损伤修复的特征是值得注意的。在我们的RD队列中，WNT/b-catenin相关通路基因SUSD2和CAV1表达增加(表S5)。我们使用IHC分析SUSD2和CTNNB1 (b-catenin)蛋白表达(图S3E和S3F)来验证观察到的转录变化。与我们的scRNA-seq结果一致的是，我们发现与TN和PD相比，RD状态中膜SUSD2显著增加，核CTNNB1 (b-catenin)显著增加。此外，在两个临床试验(osimertinib: NCT03433469或crizotinib: NCT03088930)中，从EGFR(AZ)或ROS1(NC)接受新辅助TKI治疗的患者中获得的独特的成对TN和RD样本中，CTNNB1的核定位的比较如图S3G所示。SUSD2是WNT通路激活的下游靶点(Umeda等，2018;而CAV1可促进b-catenin (CTNNB1)的核定位和WNT/ b-catenin通路的转录激活(Yu et al.， 2014)。在NSCLCs中，WNT/b-catenin信号通路有助于肿瘤的发生(Juan et al.， 2014;Nakayama等，2014;Pacheco-Pinedo等，2011)、修复和细胞损伤后的再生(Huch等，2013;Tammela等，2017)。AT2细胞的自我更新和损伤反应可特异性利用WNT/b-catenin信号通路(Nabhan等，2018;斯图尔特,2014)。此外，在EGFR突变体中，WNT/b-catenin通路的激活可能限制EGFR抑制剂的反应，并可能促进体外EGFR抑制剂治疗过程中姐妹细胞的存活(Arasada et al.， 2018;Blakely等人，2017;Casa s- self等，2012;Nakayama等，2014)。总的来说，RD状态以细胞损伤和存活的信号为特征，这些信号部分通过WNT/b-catenin通路发挥作用，而WNT/b-catenin通路可能具有治疗靶向性(Krishnamurthy和Kurzrock, 2018)。
临床数据表明，在原发性EGFR或ALK靶向治疗中，WNT/b-catenin激活在治疗早期参与促进RD和耐药细胞的发展。为了进一步探索WNT通路研究结果的治疗潜力，我们使用患者来源的PC9细胞作为EGFR突变的NSCLC模型，使用H3122细胞作为ALK融合驱动的NSCLC模型。我们测试了这一假设，即预先阻断WNT/b-catenin信号通路以及致癌EGFR或ALK将减少在初始治疗中存活的细胞数量，并在治疗开始时增加反应深度。亲代细胞分别用EGFR或ALK TKI (osimertinib或alectinib)的IC50(导致细胞数量减少50%的抑制剂浓度)剂量处理。两种不同的WNT/b-catenin通路抑制剂XAV939和PRI-724在四种先前报道的浓度或联合治疗进行了测试。我们的体外结果支持了我们的假设，证明了前期抑制WNT/b-catenin通路与同源TKI结合导致细胞融合显著且剂量依赖下降和反应深度增加(图3G 3J;数字S3H S3O)
5 Transcriptional Differences between TN and PD Cancer Cells Reveal Immune Modulation and Cellular Invasion as Key Features of Cancer Progression
（TN和PD之间的转录差异揭示了免疫调节和细胞侵袭是癌症进展的关键特征）
在比较TN和PD样本的癌细胞时，我们发现PD癌细胞中有901个差异上调基因(表S4)。在这些基因中，我们确定了参与kynurenine通路的基因以及与肿瘤发生和炎症相关的多个基因和通路(表S)。
我们观察到一个显著的(p <0.0001)在PD和TN癌细胞中，参与kynurenine通路的IDO1、KYNU和QPRT基因表达增加(图3K;图S3P;表S2)这些基因的表达可导致免疫抑制行为(Triplett et al.， 2018)，表明PD肿瘤内的癌细胞可能直接抑制免疫系统的活性。识别该通路作为PD肿瘤免疫抑制的介质具有重要的潜在治疗意义，因为IDO1在许多癌症中上调(Cheong和Sun, 2018;Hornya k等，2018;Liu等，2018)。多项临床试验试图使用IDO1抑制剂作为单一疗法以及与免疫检查点抑制剂或激素疗法联合使用来阻断这一通路(Ricciuti等，2019)，尽管成功程度有限。QPRT也表现出表达增加(p <在我们使用PC9细胞的体外模型中(图3L)，特异性地观察了EGFR抑制剂治疗(即类似于临床PD)的获得性耐药，这进一步证实了这一途径表明了在治疗的选择性压力下癌症进展的迹象。
为了进一步证明kynurenine通路的临床相关性，我们再次使用TCGA肺腺癌RNA-seq数据集。该特征的高肿瘤表达是患者OS较差的生物标志物(p <0.05;图3米;表S6)。这与这一途径的激活导致免疫抑制和免疫系统无法有效地监视和根除癌细胞的观点是一致的。
6 scRNA-seq Profiles of Cancer Cells Change from RD to PD
（从RD到PD状态单细胞癌症细胞的转变）
我们比较了RD患者和PD患者样本的癌细胞，以阐明PD由RD产生的过程中的差异，发现共有2182个基因具有显著性差异(p <(0.001) RD或PD的表达增加(NRD = 1,121, NPD = 1,061)(表S4)。在RD的差异过表达基因中，与肺泡细胞特征、细胞生长、分化、细胞运动和肿瘤抑制相关的基因(表S5)。RD癌细胞过表达表面活性基因(SFTPB/C/D和SFTA3)，这是肺泡细胞特征的一部分(图3A;图S3B) (Desai et al.， 2014;Treutlein等，2014;Wang等，2018)。此外，NKX2-1和NFIX在RD癌细胞中过表达，并与细胞活性降低相关(Ge等，2018;Rahman等人，2017年;Winslow等人，2011)。NKX2-1的低表达导致分化的丧失和肿瘤播种能力的增强(Winslow et al.， 2011)。这一研究和之前的RD癌症细胞分析的共同发现表明，细胞的损伤-修复和再生状态可能促进癌症细胞的惰性，增加肿瘤控制和改善临床结果。
相比之下，PD肿瘤细胞与侵袭、细胞间通讯、分化和免疫调节相关的基因差异过表达(表S5)。纤溶酶原激活通路的多个基因(ANXA2, PLAT, PLAUR, PLAU)显著过表达(图3N)，纤溶酶原抑制剂SERPINE1 (PAI1)显著过表达(p <0.0001,图3 o;图S3Q)。ANXA2和PLAUR是纤溶酶原活化级联中的受体蛋白，通过降解细胞外基质参与炎症、血管生成、侵袭和转移(Kubala et al.， 2018;(朱等，2017)。ANXA2或PLAU分别与PLAT (uTa)或PLAU (uPa)结合时启动信号传导。然后，纤溶酶原通过PLAT和/或PLAU的活性降解为纤溶酶，导致金属蛋白酶的激活和纤维蛋白的降解。SERPINE1在许多癌症亚型中表达增加，并在细胞粘附、侵袭、肿瘤血管化、放射抵抗和免疫抑制中发挥重要作用(Kubala等，2018;(朱等，2017)。纤溶酶原激活信号的高表达与患者OS的恶化有关(p <TCGA肺腺癌RNA-seq数据集和队列内(图3P;表S6)。同样，在这个独立数据集中，SERPINE1的高表达与较差的OS相关(p <0.05)(图3 q;表S6)。EGFR抑制剂治疗可诱导SERPINE1和EGFR突变体的表达，在EGFR抑制剂治疗期间SERPINE1 (PAI1)血浆水平诱导超过2倍的患者，证明其无进展生存期缩短(Arasada et al.， 2018)。总的来说，我们的scRNA-seq发现阐明了纤溶酶原活化级联在临床预后不良和靶向治疗耐药中的临床相关性和潜在作用。
此外，我们发现PD肿瘤细胞与RD肿瘤细胞中有几种间隙连接蛋白过表达差异(p <0.0001,图3 r;表S2)。间隙连接蛋白(如连接蛋白)是一种整合的膜蛋白，可在细胞间进行离子、代谢物和二级信使的胞内交换(Aasen et al.， 2016;Sinyuk等，2018)。而一些已被鉴定为肿瘤抑制子，我们发现GJB2/3/5高表达(图S3R;表S6)与TCGA肺腺癌RNA-seq数据集中较差的生存率有关(p <0.001)(图3)。这些集体发现表明，不仅在我们的队列中，而且在更普遍的nsclc中也存在促肿瘤效应。
在癌细胞中，我们发现了一个丰富的复杂性临床相关，表达突变可能影响治疗反应。此外，对不同治疗时间点的单个癌细胞的转录谱进行评估，确定了几种临床相关的细胞状态变化(图S4A)。我们发现，无论癌基因驱动突变的类型(EGFR或ALK)(图S4B S4K)和活检部位(原发或转移)(数据未显示)，所确定的治疗时间点特征大多持续存在。虽然我们发现这些癌细胞的特征是强大的，但重要的是要承认样本之间存在患者异质性(图S4L S4O)。
7 Longitudinal scRNA-seq Analysis of an Individual Patient’s Tumor during Treatment
（一个病人在治疗期间，对其肿瘤的单细胞RNA-seq分析）
由于大多数肿瘤在TKI治疗期间会有50%或更大的退行率(尽管不完全)，因此在治疗前和治疗期间获得晚期肺癌患者的连续临床肿瘤活检具有挑战性(Camidge et al.， 2019;Soria等，2018年)。然而，我们从一名患者(TH226)的同一原发肿瘤的3个治疗时间点获得了样本，该患者的肿瘤包含标准的EGFR 19外显子缺失致癌突变，并使用EGFR抑制剂osimertinib进行治疗(图S5A S5C)。在所有3个活检中，我们通过癌细胞中EGFR 19外显子驱动突变和其他几个突变的scRNA-seq RNA表达鉴定(图S5D)。
当将TH226与其余的scRNA-seq数据集进行比较时，我们发现了重叠的差异表达基因和签名(表S4;数字S5E S5H)。有趣的是，我们还发现与鳞状细胞分化相关的许多基因(KRT16、KRT14、KRT6A、KRT5、CLCA2、PKP1、ANXA8、DSG3)在PD时比TN和RD时过表达(p <0.0001，图S5I，表S4和S5) (Ben-Hamo et al.， 2013;Chao等人，2006年;Goodwin等，2017)。这是特别有趣的，因为PD患者的肺肿瘤活检显示，从之前的活检显示的纯腺癌组织学转变为鳞状细胞癌(图S5C)。鳞状细胞癌的组织学转变是EGFR突变的NSCLCs对EGFR抑制剂耐药的机制(Izumi et al.， 2018;Jukna等，2016)。因此，scRNA-seq能够提供高分辨率、基因和通路水平的观点，以了解癌症药物治疗过程中产生的生物学和组织学可塑性。
8 Inversion of Myeloid and Lymphoid Infiltration within the TME at Progressive Disease Compared to RD
（进展性疾病与RD相比，TME内骨髓和淋巴样浸润倒置）
接下来我们讨论了靶向治疗期间TME的演变。免疫细胞(n = 13,431)被聚集并注释(图4A;表S1和S4)。与肿瘤细胞聚集(主要是患者特异性的)相比(图S2C和S2D)，免疫细胞类型聚集显示了较低的患者占用率(图4B)。这与预期是一致的，在患者和样本中发现常见的免疫细胞表型。
我们比较了所有3个时间点的免疫细胞组成，表示为部分免疫细胞丰度载体之间的相关性。RD内的免疫组成与其他两种处理状态的差异最大(r = 0.78对TN样本，r = 0.82对PD样本，Pearson s相关系数)(图S6A)。在所有的治疗时间点，T细胞和巨噬细胞都是优势细胞群，并在肿瘤反应和耐药过程中表现出相对丰度倒置，我们进一步研究了这一发现，如下所述(图4C)。与TN或PD样本相比，在RD时TME中T细胞占所有免疫细胞的更大比例(TN为27%，RD为46%，PD为31%)。巨噬细胞浸润呈相反的模式，与TN和PD相比，RD时巨噬细胞减少(TN为37%，RD为21%，PD为37%)。
在2例患者中，我们检查了在不同治疗时间点获得的匹配肿瘤活检的免疫细胞(TH226和TH266，分别图S6B和S6C)。在对TH266患者进行的2次肿瘤活检中，巨噬细胞和T细胞均显示巨噬细胞的比例降低，而T细胞从TN到RD的比例增加，结果与整个队列相匹配(图S6D)。TH226表现出与治疗开始后RD时巨噬细胞比例减少，PD时再次增加的模式相似(图S6E)。我们使用免疫荧光染色对组织样本进行了验证(图4D 4F;图S6F)。此外，我们将NSCLCs的TCGA大容量转录组数据分解为部分免疫细胞类型(参见星型法)，发现含有高比例巨噬细胞的TCGA样本OS明显更差(p <0.01)(图S6G)。这支持了我们的观察结果的临床相关性，并与之前关于手术切除早期NSCLCs患者巨噬细胞浸润与不良预后相关的报道相一致(Chen et al.， 2005;(Zhang et al.， 2011)，以及EGFR TKI治疗期间无进展生存率更差(Chung et al.， 2012)。
这些发现特别有趣，因为它们与PD-1抑制剂治疗的黑色素瘤相似(Riaz et al.， 2017)，尽管在肺癌的癌蛋白靶向治疗的独特背景下。具体来说，在PD-1抑制期间，我们观察到黑色素瘤中CD8+ T细胞和自然杀伤(NK)细胞数量的增加和M1巨噬细胞数量的减少。在不同的肿瘤组织和治疗过程中，NK/T细胞和巨噬细胞可能有共同的反应。因此，可能存在针对不同癌症亚型和治疗方式的靶向RD的保守方法，这是未来研究的一个领域。
9 An IDO1-Expressing Macrophage Population Is Enriched at PD
（在PD中富集了一个IDO1-expressing 巨噬细胞）
从肺肿瘤活检中获得的巨噬细胞(n = 1,379)被分成5个不同的组(图S7A)，每个组的基因表达差异(图S7B;表S4)。此外，我们计算了5个巨噬细胞簇中来自3个治疗组的细胞比例(图5A)。
Cluster MF0在TN细胞中轻度富集，其特征是与免疫抑制表型相关的基因(C1QC、GPNMB、APOE、TREM2、FOLR2)的表达(Cochain et al.， 2018;张等，2019;周等，2017)(图5B;图S7B)。集群MF1 RD和MF3是丰富。巨噬细胞集群MF1表达与肿瘤浸润骨髓衍生抑制细胞功能相关的先前(FCN1、VCAN S100A8, S100A9) (Zhang et al ., 2019)和THBS1和PTX3与分辨率有关的炎症、伤口愈合、抑制IL-1b (Bouhlel et al ., 2007;Faz-Lo perez等人，2016;马丁内斯和戈登，2014年;pui - kro ger等人，2009;Shiraki等人，2016;Stein等，2016;张等，2019)(图5B;图S7B)。聚集MF3表达的基因与组织损伤的促炎反应(CLEC2D, IL7R, OGT)和促炎信号传导(FYN, DUSP4, FOXO1)相关(Bao等，2018;Fan等，2010;Lai等人，2020年;Mkaddem等人，2017年;森胁和朝日，2017)。该簇中的巨噬细胞表达CCL5，这是一种细胞因子，此前被认为与促进HER2靶向治疗后残余HER2+乳腺癌的存活有关(Walens et al.， 2019)。MF4由增殖的髓系细胞群(TOP2A, MKI67)组成，组间无显著差异。PD组巨噬细胞在MF2中过度表达(图5A)，并表达促炎细胞因子CXCL9、CXCL10、CXCL11(图5B);图S7B)，有利于招募淋巴细胞进入TME (Nagarsheth等，2017)。该人群中最显著差异表达的基因还包括与冠苷酸结合的家族蛋白GBP1和GBP5，它们在ifn -g活化的巨噬细胞中被诱导，并通过炎性小体组装促进先天免疫系统内的炎症信号传导(Shenoy et al.， 2012)(图5B;图S7B)。尽管MF2巨噬细胞中有促炎基因的表达，但这组pd特异性巨噬细胞中最显著的差异表达基因是IDO1(图5B)。IDO1由TME内的炎症诱导，并通过免疫抑制髓系细胞群、调节性T细胞(Treg)分化和免疫抑制细胞因子环境促进致敏环境(Munn and Mellor, 2016)。
10 An Immunosuppressive T Cell Phenotype Is Predominant within the TME at PD
（在PD时期，一个免疫抑制的T细胞表型在肿瘤微环境中占据主要地位）
T细胞和NK细胞(n = 2,226)以巨噬细胞的方式进行分析，得到5个不同的T/NK细胞群(图5C;图S7C)。这些包括在TN样本中富集的两个种群(TC0, TC4)和在PD中富集的两个种群(TC1, TC2)(图5C和5D;图S7D)。在RD肿瘤中T细胞总体比例较高(图4C)，在RD肿瘤中没有单个T细胞簇显示T细胞过多(图5C)。
TN和PD T细胞均显示T细胞浸润相对减少(图4C)。TN状态下的T细胞被富集为T细胞群TC4和TC0。TC4表达与自然杀伤(NK)或自然杀伤T细胞(NKT)表型一致的标记物，包括NK细胞标记物(KIR2DL3, FCGR3A)和中度表达的T细胞标记物(CD3, CD8)。TC0表现为幼稚型CD8+表型表达CCR7、IL7R和SELL(图5D;图S7D) (van der Leun等，2020)。虽然整体T细胞浸润在PD时仍有限(图4C)，但具有免疫抑制特征的T细胞表型(包括T细胞簇TC1和TC2)相对富集(图5C)。TC1被鉴定为一个失功能或衰竭表型的T细胞簇，其特征是抑制受体PDCD1(编码PD-1蛋白)和CTLA4的表达(Wherry和Kurachi, 2015)(图5D)。TC2由表达FOXP3、IL2RA的Treg细胞组成。与相对免疫抑制的环境一致，PD时NK/NKT细胞簇TC4的浸润增加。
RD获得的肿瘤活检显示，TN或PD活检样本中存在更促炎、更热的TME，表现为T细胞总体比例增加和调控性T细胞浸润减少(TC2)(图5E)。与PD状态相比，RD时功能障碍T细胞(TC1)减少，NK/NKT细胞(TC4)浸润增多(图5D;图S7D)。在所有治疗状态(TC3)中都有增殖的肿瘤浸润T细胞，并且在PD样本中轻度富集。该T细胞群以细胞毒性表型(CD8, GZYMB)和PDL1/CTLA4表达为特征，可能反映了功能失能前的细胞毒性T细胞群(van der Leun et al.， 2020)。
综上所述，TN和PD TME的特征都是巨噬细胞相对于T细胞浸润;然而，这些浸润性免疫细胞的表型特征在两组之间存在差异。PD时，有IDO1+巨噬细胞群浸润，增殖的调节性T细胞浸润，以及在TN和RD时极少出现的失能T细胞浸润。而TN状态的特征是具有典型免疫抑制作用的m2样巨噬细胞占优势(Sica et al.， 2008)。相比之下，RD中没有功能失调或免疫抑制基因表达模式的T细胞浸润增加，免疫抑制巨噬细胞浸润减少(图5E)。
Discussion
目前还没有完整的单细胞转录数据目录，可以用来了解细胞状态和治疗引起的疾病生物异质性的进化，如癌症，特别是晚期实体恶性肿瘤。转移性疾病的患者不常规接受手术切除作为治疗的一部分。因此，需要大量组织的单细胞图谱技术不适用于对转移性疾病组织样本的询问(Lambrechts et al.， 2018;Schelker等，2017)。我们对在不同治疗时间点从患者获得的晚期NSCLC活检进行了scRNA-seq分析，阐明了个体肿瘤样本中丰富的突变和转录多样性，以及治疗期间癌细胞的转录谱和TME成分的动态变化。我们的发现提供了一个路线图，强调了潜在的细胞生态系统和机制，可以为更好地治疗癌基因驱动的癌症提供信息。
我们的研究提供了罕见的临床相关生物学过程的特征，这是一个治疗阶段，很少捕获的人类实体恶性肿瘤。我们的scRNA-seq数据显示，肿瘤细胞中表达的致癌改变存在广泛的肿瘤内异质性(图2)，不仅显示了假定的致癌驱动因子的表达，还显示了额外的致癌突变(图6，#1)。这提供了一个潜在的解释，为什么完全反应的治疗是罕见的。肿瘤有适当的遗传框架和进化剧本来进化抵抗。这些硬连接的特性不能被当前的批量取样分析检测到。我们通过scRNA-seq分析证实，治疗诱导的转录可塑性增强了治疗期间肿瘤的恢复和进化。我们发现了针对不同治疗时间点和临床状态的转录特征(图3和图6，#3、#5、#6和#7)。这些标记中的大多数是OS明显恶化的生物标记，在帕金森病中最为显著。相反，我们发现RD时肺泡细胞特征增强，并与生存率提高相关。这一特征显示出与细胞可塑性和损伤反应相一致的特征，可能表明一种治疗诱导的适应性表型，它允许癌细胞存活，尽管处于较弱的侵袭状态(Wang et al.， 2018)。我们的数据也强调了肺泡细胞特征与WNT/ b-catenin通路的联系，这是损伤反应和再生的机制。尽管WNT/b-catenin通路具有潜在的治疗靶向性(Krishnamurthy和Kurzrock, 2018)，但确定如何最好地调节该通路以影响剩余癌细胞的存活，从而对临床有益，这将是至关重要的。我们的数据强调的一个基本原则是，通过利用特定细胞状态的靶向治疗，我们可能能够设计癌症(或TME)细胞命运，以改善转移性实体恶性肿瘤的治疗反应。如果部署在适当的时间,治疗目标负债特定细胞的状态或防止进一步适应可能有助于改善病人生存通过约束肿瘤继续进化向完整的耐药性(表1)。承认通道oncogene-driven非小细胞肺癌是肺癌的一个子集,不适应当前检查点抑制剂免疫疗法(Gainor et al ., 2016;(Mazieres等人，2019)需要进一步了解该患者群体的免疫环境。我们找到了一个相对较低的T细胞浸润的时差TN和PD患者(图5 c和5 d),与之前的报道一致低细胞毒性T细胞浸润在首次治疗表皮生长因子受体突变的非小细胞肺癌(Gainor et al ., 2016)和EGFRactivation之间的关联和免疫抑制表型在临床前模型(Akbay et al ., 2013;Jiang等，2019)。我们的结果发现，RD在靶向治疗过程中诱导了更多的炎症表型，其特征是T细胞浸润(图6，#4)和免疫抑制巨噬细胞浸润减少(图5E)。这种炎症状态可能代表了肺泡细胞、损伤修复和癌细胞间室(如上所述)的再生状态的补充，并可能导致癌细胞和TME之间的串音。这些TME变化是短暂的，因为在PD时，ido1表达的巨噬细胞、调节性T细胞和其他免疫抑制T细胞群富集。这些都是环境敌对的特征以建立有效的免疫反应(图6、图9和图10)。这些发现证实了在EGFR突变的NSCLCs的临床前模型中报道的结果，这些结果表明，尽管长期TKI治疗后观察到免疫抑制表型，但在初始EGFR TKI暴露后，有可能出现短暂的免疫刺激效应(Dominguez et al.， 2016)。的诱导免疫刺激性表型在靶向治疗(例如,在RD)可能提供一个机会之窗引入小说时间靶向性联合疗法治疗期间早些时候,或许在采访中更有利的时间去增加抗肿瘤最初反应和巩固responsein综合治疗的方法。
考虑到癌细胞信号转导和TME是相关的，可能有针对这两个部位的治疗策略，图6。scRNA-seq资料揭示临床状态特性的肿瘤细胞生态系统功能共同所有时间点左上的象限所示,包括多个致癌司机(1)的存在。功能共享在RD和PD右上象限所示,包括各种入侵信号通路在RD(2),功能独特,显示在右下方的象限,包括肺泡签名(3)和T细胞比例增加(4)。PD独有的特性,如图左下方象限所示，包括纤溶酶原激活通路上调(5)、间隙连接蛋白表达(6)、肿瘤抑制基因丢失(7)、促炎趋化因子表达(8)、Treg数量增加(9)和kynurenine签名表达增加(10)。同时。kynurenine途径就是一个例子。我们发现在PD时，肿瘤细胞和髓细胞中kynurenine通路激活增加(图6，#5)。IDO1作为kynurenine通路中的速率限制酶，可以影响TME的多种成分，包括T细胞和髓细胞群，以及有利于免疫抑制的血管生成(Munn和Mellor, 2016)。使用IDO1抑制剂作为结合PD1/PDL1(程序化细胞死亡蛋白1/程序化死亡配体1)checkpoint抑制剂的联合免疫治疗策略的一部分，在早期研究中显示了前景(Siefker-Radtke et al.， 2018)，但未能证明改善晚期黑色素瘤的预后(Long et al.， 2018)。我们展示了不同的不断进化的TME状态，表明可能存在一个机会窗口，此时kynurenine途径抑制剂可能更有效(图6;表1).本文提供的scRNA-seq数据集证明了在积极靶向治疗晚期实体恶性肿瘤患者期间，对临床相关时间点纵向获得的肿瘤活检进行scRNA-seq的可行性。这些数据为制定消除或中和RD的策略提供了基础，从而在不同治疗方式下对晚期NSCLCs和潜在的其他实体恶性肿瘤患者产生更持久的反应。
Limitation of Study
我们研究的局限性包括单个肿瘤活检的细胞数量、多样性和基因型，这是由于使用小针活检或液体收集，而不是更大的手术切除。由于现实组织采集的挑战，我们从2020年9月3日文章个体患者中获得了少量的ll 1244细胞182,1232 1251的匹配样本。由于RD在标准治疗期间没有取样，因此在这种疾病状态下的样本较少。单细胞来源的转录组相对稀疏，这是多种因素综合作用的结果，包括转录随机性、采样mRNA分子的稀罕性、cDNA合成和文库制备过程中mRNA分子扩增不均匀以及文库分子的稀疏阅读覆盖率(Borel et al.， 2015;Deng等，2014;Fan等，2018)。这些挑战限制了我们使用单细胞数据进行饱和突变分析的能力。