本文发表在MOLECULAR CANCER,https://doi.org/10.1186/s12943-020-01178-6,喜欢的小伙伴可以去下载。
肿瘤再生长是放射治疗失败的主要原因。以往的研究表明，死亡的肿瘤细胞通过促进残留的肿瘤再生细胞(TRCs)的增殖，在肿瘤再增殖过程中起着至关重要的作用。然而，TRCs在放疗后也会遭受DNA损伤，并可能在濒死细胞释放的增殖因子的刺激下发生有丝分裂灾难。因此，我们打算找出这些自相矛盾的生物学过程是如何协调起来的，以增强放疗后肿瘤的再增殖。垂死的肿瘤细胞来源的外体诱导G1/S阻滞，促进DNA损伤反应，通过传递miR-194-5p进一步调节E2F3的表达，从而增强TRCs的存活。此外，外体miR-194-5P可减轻放疗时致癌HMGA2的毒副作用。在潜伏一段时间后，垂死的肿瘤细胞进一步释放大量的PGE2来促进恢复的TRCs的增殖，并协调了再繁殖级联反应。值得注意的是，小剂量阿司匹林被发现通过抑制外切体和前列腺素E2的分泌来抑制胰腺癌放疗后的再生长，直接上图吧，说的太多了，听不明白。
本文从临床表现———胰腺癌放疗后增殖加速——出发，从而开展临床研究。放疗过程中的DNA损伤如果不被修复的话，会出现细胞死亡，所以必定会存在肿瘤细胞在放疗后周期进程阻滞而且伴随DNA修复，而且，在这个过程后，肿瘤增殖增速？？？？厉害了，这听着像不像肿瘤干细胞特性。安利一个胰腺癌干细胞标记（c-met、CD44、CD133、LGR5、ALDH1），这个TRCs是不是也是这样呢，这种DNA损伤诱导细胞死亡而且又有快速增殖过程，是不是矛盾？看作者作何解释
作者先用10y辐照后的细胞（feeder）与报告细胞培养，发现24小时内肿瘤增殖受到抑制，阻滞在G0-G1期，但是36小时后被逆转。和辐照后的细胞培养液上清培养时也有类似表现。
作者把辐射后的细胞与未辐射的细胞进行了转录组测序，GO分析表明在细胞外囊泡生成功能上富集。
那问题来了，是不是辐射后的外泌体分泌增多了呢？作者又是一顿验证。果不其然，确实如此。具体方法就是收集外泌体后进行NTA计数。
在患者肿瘤裸鼠移植物模型（PDX）也发现照射后外泌体指标（CD63，CD81，TSG101）表达升高，将受辐照的细胞外泌体与肿瘤培养提，EDU实验表明肿瘤生长受到抑制。
辐照细胞的外切体耗尽的CM失去了抑制作用。BrdU掺入试验表明，体内给药照射的垂死肿瘤细胞来源的外泌体也抑制了皮下肿瘤的增殖。这些数据表明，增殖抑制作用在很大程度上是由于死亡的细胞来源的外切体所致。
作者也真是受累，到现在只验证了外泌体在这个过程的作用，接着作者又作了克隆形成实验，验证外泌体处理后的肿瘤细胞增殖能力的，这不应该是受到辐射的肿瘤外泌体抑制肿瘤增殖吗？可是结果却是这个，这个表型我也是困惑了，不明白所以。（作者先用辐射与未照射的外泌体处理细胞后再照射，用过照射的外泌体处理的细胞显示出克隆形成能力增强）
GW4869在非辐射时对肿瘤增殖没有影响，在辐射后对肿瘤增殖起到抑制作用？我觉得不加GW4869也会得到这个结果。让我越来越看不懂了。自此，得到结果：从垂死的肿瘤细胞中提取的外切体可以促进辐射后的细胞存活。WTF.
体外表型做完了，是不是该做体内了，安排上裸鼠上场，PDX模型建立，分组：对照组CTRL,照射组rad，照射+GW4869,单用GW4869；得出结论：照射后的PDX肿瘤在滞后期后显示加速再繁殖，即使来自不同患者的肿瘤之间存在微小差异。令人惊讶的是，当PDX小鼠同时接受GW4869治疗时，肿瘤再生长显著减慢，并延长荷瘤小鼠的存活时间(图I)。此外，更多的Ki-67+细胞驻留在受照射的肿瘤中，同时GW4869治疗显著减少，表明辐照致死肿瘤细胞外泌体促进了肿瘤增殖啊。我的天，一会抑制，一会促进，我已晕，众人别扶，我还能看，你这个P1、P2怎么来的，怎么界定的啊！全文没有说明，WTF，我裂开了。总之，体内，体外表型做完了。接下来该干什么了呢？机制啊！！我觉得不等我看完我将四分五裂
还记得刚开始说到的干细胞吗？感觉作者还没扯到这个方面上来啊，没有老八干不了的，奥利给，干就完了。辐射后肿瘤细胞都苟延残喘，总用一些顽强的活了下来，并且继承了前辈的衣钵将至死不渝的精神发扬光大，下面，一起来找找这些TRCs。作者猜测可能就是这些个TRCs接受了这些垂死细胞释放的外泌体，完成了上述的抑制后增殖的过程。这听着感觉TRCs对放疗不敏感啊。怎么识别这些细胞呢？还是找差异，把照射和没照射的拿出来对比一下干细胞相关基因表达情况，发现84个靶基因中的62个被鉴定为上调。特别地，11个统计上显著改变的基因中有10个上调，在照射后的PANC-1细胞中，CD24+细胞和CD326(ESA)+细胞的比例显著上调,显示肿瘤干细胞特性。
辐射后ALDH1A1的表达显著上调，ALDEFLOUR™实验显示，放射后存活的癌细胞和原代胰腺肿瘤细胞中ALDH+细胞的比例显著升高qPCR分析和Westernblot表明，ALDH1A1在照射后的胰腺癌细胞和PDX肿瘤组织中表达上调。免疫组化(IHC)染色进一步显示照射后PDX肿瘤组织中ALDH1A1+细胞高度富集。然而，GW4869显著抑制了ALDH1A1+细胞的积累。你细品，又是这个P1、P2。也就验证了ALDH1A1+细胞就是要找的TRCs。
怎么来标记这个ALDH1A1+细胞和ALDH1A1-细胞呢，作者构建了一个条件表达系统，就是加入4-羟基三苯氧胺(4OHT)诱导后ALDH1A1的表达，显示蓝色，不表达的的时候显示红色，这个思路不错，需要的可以拿去哈！具体制作的病毒，也是公司构建的吧！
效果怎么样，照就完了。祭出我40米的砍刀削一下你15米的铅笔。
不适说过有个外泌体释放抑制剂吗？他是不是应该出来表示一下存在。安排上
这么顽强的TRCs在队友快要嗝屁的时候是怎么含泪舔盒的，一起培养看看吧。让我看到了肿瘤细胞的无私。一瞬间觉得它们并没有这么可恶了。
好了，以上说了肿瘤细胞怎么存活下来的，以及鉴定了在后期增殖过程中起重要核心作用的TRCs（我觉得就是干细胞啊），下面就看看这些细胞也受到辐射损伤后自己是怎么在队友帮助下修复的了。基础知识科普一下，在X线照射后，主要损伤的还是GENE，会出现错配、断裂和S=S等情况，所以，这些活下来的肿瘤细胞必定需要DNA修复，验证一波走起。在PDX上观察一下细胞形态，看到没有，它们活过来了。可见,TRCs细胞也未能幸免。但是加入GW4869后即使50天了，DNA损伤还是存在的。说明了外泌体在DNA损伤修复过程中是起到保护作用的。
在体外也看看刚才构建的那个细胞系什么情况。是不是很直观，GFP+细胞能够很快从DNA损伤中恢复过来。来自受辐射死亡的肿瘤细胞的外体显著加速了受辐射细胞中γ-H2A.X和pATM的清除。文末会科普一下彗星拖尾实验（一中观察DNA损伤的实验）
以上说了外泌体参与到了TRCs的修复过程中，到底是哪种成分呢，它又起到什么作用呢？来来来，瓜子、板凳准备好。提到外泌体，它其中的货物最常见的也是最有可能的就是miRNA，这种非编码RNA在翻译、转录过程中调节作用很广泛（罩不住人家多啊）。作者又进行了外泌体miRNA-seq。看看，还是找差异表达的基因。
发现两个经过验证的miRNAs，miR-196b-5p和miR-194-5p，在濒临死亡的肿瘤细胞来源的外体中显著上调，作为p53诱导的miRNA，miR-194可能参与基因组稳定。那还说啥，就你了。这下来又是一通验证，是不是存在（CM外泌体，血浆外泌体），预测结合蛋白，功能验证（gain or loss of function），miRNA的对照组是MIMICs。这就没外泌体什么事了。以后实验在靶细胞中进行就行了。
别慌，从头再说一次，不是说垂死的细胞外泌体存进了G1/S期阻滞吗？还有刚才的DNA修复，作者可没忘，又回头验证了一遍。这个克隆形成，我真是无法理解了，我要裂开了。这个只能解释成只有在辐射条件下这个microRNA才对克隆形成又促进作用。不辐射的时候它就抑制肿瘤增殖。我此刻一脸问号，WTF。
还记得找TRCs构建的条件表达基因吗？这次作者又故技重施，构建了多西环素诱导miR-194-5P表达。我就不上图了，其实原理都一样，结果也和上面的一样。那个DNA损伤的WB上一个吧。
这下microRNA功能也验证了，该找靶点了吧。这个还是需要网站预测，一般都是多找几个预测网站，然后取个交集，作者再把靶点蛋白进行KEGG通路分析，找到了E2F3参与了细胞周期。然后双别荧光素酶报告实验证明E2F3是miR-194-5p的直接靶点，又验证了E2F3在DNA损伤中的作用、细胞周期中的作用、以及在克隆形成中的作用（这个克隆形成此刻应该能体会到我的怒火）以上都是一般套路和其前面说的一样。不上图了。验证了microRNA表达上调，抑制了E2F3的表达，促进DNA损伤修复。E2F3过表达促进了细胞周期的进展和EDU的掺入。DNA损伤后，一定不能使增殖加速，要不然细胞只有死路一条。
先前的研究确认HMGA2和E2F3是胰腺癌八个关键调节中心中的两个[27]。HMGA2与E2F3在胰腺癌中的表达呈正相关，出人意料的是，据报道，具有癌前干化能力的癌基因HMGA2与miR-194相互作用。我们发现HMGA2负调控miR194-5p的表达。经tcga数据库分析，hmgA2和miR-194-5p在胰腺癌中也呈负相关（这也是坐着神来之笔啊，真是好文自有天助，这要是不说谁能想到HMGA2这个玩意儿），作者又把刚才micro那个实验验证的东西又又又拿过来验证了一下（经费在燃烧啊）。
HMGA2的过表达促进了胰腺癌细胞的增殖，与正常胰腺组织相比，胰腺癌组织中HMGA2的表达显著上调。ALDH1A1+胰腺癌细胞也显示HMGA2表达增强。同时，HMGA2过表达的细胞表现出更多的干细胞样特征，如较高比例的ALDH+细胞。TRCs中富集的HMGA2促进了它们的干性和癌症进展，但对辐射后的TRCs的存活和恢复有潜在的不利作用，而来自垂死的肿瘤细胞的外体miR-194-5p在放射治疗下瞬时逆转了HMGA2的作用，以保护TRCs。
再总结一下：microRNA-194-5P抑制了克隆形成能力，促进了肿瘤在辐射后的DNA损伤修复，但是HMGA2可以促进克隆形成，但是在辐射后HMGA2的功能受到的短暂抑制，而后又恢复了。就这逻辑能力，我是佩服的五体投地。我似乎还忘了些什么啊，对了PGE2。作者，来坐下来继续聊啊。PGE2这是一种脂质啊，作者作了ELISA定量看看CM中的含量变化，发现随着时间延长，PGE2也是增多的。PCR也验证了，为毛未辐射 的也多了啊。
PGE2产生的关键酶COX-2是不是也随着变化了，前面不是说外泌体照射后增多了吗，那相关的酶是不是也有这种时间依赖性变化，验证。
然后，你明白的，作者真是钱多不怕花，gain and loss of function of PGE2.这里就简单多了，PGE2可以直接买，抑制的话就用COX-2抑制剂就行，得出结论，PGE2促进肿瘤生长。但是不影响外泌体蛋白表达。这样说PGE2还有助于增强肿瘤放射治疗的敏感性啊！我是不是发现了什么不可告人的秘密。（这个塞来昔布并没有抑制COX-2啊！作者，有必要解释一下啊）
综上所述，这些结果表明，垂死的肿瘤细胞释放的外切体和PGE2介导了肿瘤再增殖的级联反应，其中外切体miR-194-5p首先抑制细胞增殖以促进TRCs的恢复，然后PGE2促进恢复的TRCs的加速增殖。下面又一个大拿上场了——阿司匹林，作者以前发现阿司匹林具有抑制肿瘤的作用，这次也安排上，不仅抑制辐射肿瘤生长，也能抑制外泌体分泌，然后抑制了外泌体介导的那些作用：逆转辐射细胞周期改变，DNA损伤加重、PGE2释放减少、抑制了辐射细胞克隆形成能力。
至此，文章结束了。感觉读下来是多么不易。什么HMGA2、PGE2、miR-194-5p、E2F3、阿司匹林，那个作用强，那个作用弱，哪个先，哪个后，我已经理不清了。喝口水，缓缓。
补充下小知识：彗星实验（Comet assay）也被称为单细胞凝胶电泳实验（Single cell gel electrophoresis，SCGE），是一种在单细胞水平上检测DNA损伤的技术。当各种内源性和外源性 DNA 损伤因子诱发细胞 DNA 链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA 以及其他成分均扩散到电解液中，而核DNA由于分子量太大不能进入凝胶而留在原位。电泳过程中，如果DNA没有损伤，则将停留在原位，染色后呈圆形的荧光团，无拖尾出现。如果DNA受损，断裂的碎片进入到凝胶中，在电场的作用下，DNA碎片离开原位向阳极迁移，形成拖尾。DNA受损越严重，断裂越多，产生的碎片就越多、越小，则向阳极迁移的DNA碎片量就越多，迁移距离也越长，荧光染色后就能看见“彗星”样尾长并且荧光强度增强。