2021-09-10 单细胞Ribo-seq

  Ribo-seq，即Ribosome profiling，是一种大规模研究细胞中翻译组的高通量测序，它可以鉴定到某一时刻下所有核糖体结合的mRNA序列。由于细胞中的mRNA与其蛋白产物之间存在着翻译这一可被调控的过程，因此mRNA的表达水平往往并不能直接反映其表达的蛋白质的水平。而Ribo-seq则可以实现从RNA的角度研究蛋白质翻译效率以及表达水平。
常规的Ribo-seq一般需要大量的细胞进行实验，而今天分析的则是单细胞层面的Riob-seq（single cell Ribo-seq，scRibo-seq）。

scRibo-seq

scRibo-seq实验原理：相比常规Ribo-seq，scRibo-seq首先进行单细胞分选，然后对单细胞进行裂解释放核糖体-mRNA复合体。经过MNase核酸酶切后，可以获得核糖体保护的RNA片段。对这些片段进行小RNA文库构建同时引入UMI，可以实现对不同细胞的RNA的特征性标记，混合后扩增进行NGS。
scRibo-seq的发现：研究者在缺失精氨酸（Arg）和亮氨酸（Leu）的培养基中进行细胞培养和scRibo-seq后发现，不同细胞对Arg和Leu缺乏的RNA翻译停顿响应不一样，进一步的分析则表示，这种停顿与细胞所处的细胞周期相关。
PS.
1.从实验流程看来，scRibo-seq主要是引入单细胞分选，然后进行核糖体保护RNA的分离与文库构建。在传统Ribo-seq中需要进行rRNA的去除与核糖体保护RNA的PAGE纯化，以尽可能富集核糖体保护的mRNA片段。而在scRibo-seq中并没有rRNA除去的步骤，对片段大小的选择也是在最后的文库构建完成后进行的。而从最终获得的结果来看，scRibo-seq中rRNA的比例居然比传统Ribo-seq的还要低很多，有点不解！而对于比对到tRNA上的序列，则是scRibo-seq要比传统Ribo-seq高出很多，甚是疑惑。
2.scRibo-seq使用的是MNase 进行RNA的消化，传统Ribo-seq则多采用RNase I。RNase I对RNA的消化没有碱基偏好性，而MNase则存在明显的A,U偏好。因此MNase获得的核糖体保护RNA的片段大小也比RNase I的要大；而为了矫正MNase带来的这种碱基偏好，研究者还基于机器学习算法专门开发了用于scRibo-seq的分析算法与流程。很好奇直接使用RNase I会怎样？

Ref
VanInsberghe, M., van den Berg, J., Andersson-Rolf, A., Clevers, H. & van Oudenaarden, A. Single-cell Ribo-seq reveals cell cycle-dependent translational pausing. Nature (2021).