20年的一篇nature immunology，做的是中性粒细胞的单细胞测序。因为中性粒细胞存活时间很短，所以研究相对较少。这一篇做的比较全面，有比较好的参考意义。
1. scRNa-seq analysis of steady-state BM, PB and spleen neutrophils.
Fig 1a：分选小鼠骨髓，血液和脾脏的中性粒细胞，进行单细胞测序。血液和脾脏：分选Gr1+细胞；骨髓：40% cKit + 60% Gr1细胞
Fig 1b：得到了19582个高质量细胞，细胞的平均基因数在1241，测到的基因总数在18269。聚类得到8个群（G0–4，G5a–c）。
Fig 1c：G0–4主要来源于骨髓，代表着粒细胞在骨髓中的分化。G5a–c则主要来源于外周血和组织。
Fig 1d e：8个群的marker gene热图和气泡图（G5a-G5c的差别很不明显嘛，尤其是G5a。❗️但是作者在后面从分化角度给出了合理解释❗️）。
从d和e图的结果，作者推测G0群主要包含granulocyte monocyte progenitor (GMP)细胞，因为它们表达Cd117 (Kit), Cd34, Sox4和一些neutrophil primary granule genes。G2群和一部分由G2扩增来的G3也表达次级颗粒基因比如Ltf, Camp和Ngp，G4群则是骨髓里分化比较成熟的细胞，高表达Mmp8(encoding a key granule protein for neutrophil-mediated host defenses)和Cxcl2(important for neutrophil mobilization)。
Fig 1f：不同细胞群的代表性通路。细胞周期相关基因在粒细胞成熟早期细胞群G0, G1, G2中高表达。
Fig 1g：作者也做了hierarchical clustering。和UMAP的结果一致，外周血的中性粒（G5a, G5b和G5c）的距离更相近，和骨髓中性粒（G1–4）则相距较远。
Fig 1h：拟时序结果也提示存在从骨髓到外周组织的分化
Fig 1i：细胞周期相关基因在不同细胞群的热图，发现G1-G2细胞存在快速扩增，但细胞分裂在G2就停止了(G3没有表达相关基因)。一部分由G2扩增来的G3也表达次级颗粒基因比如Ltf, Camp和Ngp（Fig 1e）。
Fig 1j：计算了不同细胞群的成熟评分，G5的细胞具有最高的成熟度。
2. Characterization of BM and PB neutrophil subpopulations
中性粒细胞能合成杀灭微生物的多肽和蛋白水解酶。这些酶协助杀死和消化微生物，但若释放不当就会损伤宿主。颗粒是高度不均一性的，这有利于中性粒细胞能梯度地、定性地释放颗粒蛋白，最大限度地避免对宿主造成损伤。 根据标志酶或位于颗粒的基质和颗粒及分泌泡质膜上的其他蛋白质的特征，已发现中性粒细胞含有四种颗粒亚系，它们分别是嗜天青蓝颗粒（也称初级颗粒）、特异颗粒（也称次级颗粒）、白明胶酶颗粒和分泌型囊泡，简称分泌泡。
- 乳铁蛋白(LTF)阳性的颗粒通常被定义为specific (secondary) granules
- LTF阴性但是gelatinase阳性的颗粒被定义为白明胶酶/3级颗粒（gelatinase/tertiary granules）
Fig 2a-c： 四种颗粒在不同细胞群中的基因表达和评分
中性粒细胞成熟包含五个morphological stages：myeloblasts; promyelocytes; myelocytes; metamyelocytes; band cells and segmented neutrophils。作者随后单细胞分群和中性粒形态分群的相关性
Fig 2d-f：根据c-Kit 和 Ly6G的表达对中性粒细胞做了流式分选(d)和bulk RNAseq。大多数在单细胞数据中检测到的molecular signatures在bulk数据中也得到了证实(e)。反卷积算法计算了不同中性粒单细胞群和形态学上的一致性。Myeloblasts是G0和G1的混合，promyelocytes主要是G1，myelocytes是G1/G2，metamyelocytes是G2，band cells and segmented neutrophils主要是G3/G4。
随后作者对血液和脾脏（外周）的三群中性粒细胞进行了分析
Fig 2g-h：三群粒细胞的marker基因热图和富集结果，G5a群和G4群一样高表达Mmp8和S100a8，富集结果显示这群细胞与中性粒细胞迁移和炎症反应相关。G5b细胞表达一系列ISG相关基因。拟时许结果提示G5c细胞由G5a和G5b分化而来(Extended Data Fig. 3b)
Fig 2i-j：aging gene的热图和评分图也提示G5c细胞具有最高的Aging score。
3. Analysis of neutrophil subpopulations by flow cytometry
前面的结果提示单细胞鉴定出的骨髓分化中性粒细胞亚群 (G0–G4) 与粒细胞形态分群有很好的相关性，提示着根据marker来对中性粒分群的可能性。
所以这一部分就是用流式验证前面的单细胞分群结果
Fig 3a-c：根据Ly6g和Ckit来分析G1G2群，由于Cxcr2在G4群高表达，又添加了Cxcr2这个指标来区分G3G4群。流式得到的G1-G4细胞比例结果和单细胞数据(1c)较为相似。
Fig 3d：流式验证G5a-c三群。G5b：IFIT1；G5c：是相对aged neutrophils，高表达CXCR4，因此使用IFIT1−CXCR4hi来区分；G5a：IFIT1−CXCR4lo。
Fig 3e-f：分选出来的G5a-c三群细胞，又进一步通过marker gene的表达确定了它们的identity。
Fig 3g：流式得到的细胞比例和单细胞一致。
4. The trajectory and transcriptional control of neutrophil maturation
Fig 4a：随后作者使用velocity重建了细胞轨迹。和fig 1h的monocle一致，中行粒细胞在骨髓中的成熟(from G2 to G4)是一条单向的main branch，没有明显分支。而且G3群出现了向G4分化的strong tendency。G5c群则位于中性粒细胞分化和成熟的终末时间点。
作者随后把G3-G5亚群提出来单独做了velocity (Supplementary Fig. 4)。结果提示，很大一部分G3群出现了向G5a群的分化，提示一群外周血的中性粒是由G3直接分化来，没有经过完全的G4成熟这个阶段。BM G4群出现了两个分化方向，一部分向G5a分化，一部分向G5b分化了。因此尽管G5a和G5b在转录上非常相似（Fig. 1g），它们仍然是两个独立的PB中性粒细胞群。G5a主要由BM G3和G4分化而来，G5b则单独由G4分化而来。
Fig 4b c：G5c群也出现了最高的凋亡评分
Fig 4d：和a图一样，但只显示了PB来源的G3中性粒。不管是骨髓的G3还是外周血的G3，在分化轨迹上出现了很好的重叠，分化为G5a群，没有经过G4。与PB和脾脏中G4细胞数目较少相一致。
随后，作者想要去探究中性粒细胞分化过程中的转录因子dynamics。
Fig 4e：一些作者关注的转录因子（后面做了scenic为什么还要放这个？）。一些stem cell maintenance和early lineage commitment相关的基因，比如Gata2, Irf8和Runx1在G0群高表达。G1群高表达的基因包括Gfi1和Cepba这些中性粒细胞发育相关基因。提示specific neutrophil lineage commitment在G1发生。
Fig 4f：做了SCENIC分析并使用转录因子做了分群。
Fig 4g：转录因子分群和seurat分群有很好的相关性
Fig 4h：为了进一步探究中性粒细胞和其它细胞类型的转录差异，作者使用了一个generalized linear model (GLM)比较了各个中性粒细胞亚群和所有的非中性粒细胞群的regulon activities。鉴定出了19个neutrophil-specific networks，包括以前报道过的转录因子Cebpe, Spi1和Klf5。这个分析也鉴定出了4个新的regulon：Nfil3, Max, Mlx和Xbp1。
Fig 4i：这四个regulon与中性粒细胞特异性基因的表达密切相关。
Fig 4j：随后，作者检测了这些regulatory events是否参与consecutive neutrophil differentiation stages的transitioning。Coarse-grained clustering提示至少5个regulon groups具有特异的转录模式。包括两个早期活化的、一个晚期活化的、一个全局性活化的和一个在G2之后特异性失活的。尽管很多转录因子网络比如Cebpe, Ets1, Klf5, Rad21和E2f2参与到了neutrophil commitment，Xbp1和Mlx网络的变化特异性的与G0/G1 transition相关。此外，一些转录因子网络比如E2f1, Nelfe和Rb1的明显活性丢失提示着G2和G3之间的潜在功能变化。
5. Bacterial infection primes neutrophils for augmented functionality without affecting their overall heterogeneity
随后，作者想要去探究细菌感染怎样影响了外周中性粒细胞亚群
Fig 5a b：control和给了E.coli之后的中性粒亚群和骨髓，外周血和脾脏的中性粒比例变化
Fig 5c：看了在有和没有E.coli情况下signature molecules，NADPH oxidase components和granular proteins的表达，这些基因在给E.coli前后的表达是一致的。因此，不管有没有感染，细胞亚群的identity是没有变化的。
Fig 5d：感染前后中性粒亚群还是存在着一定的上调和下调基因。
Fig 5e：给E.coli前后各细胞群的差异基因富集。在G0和G1群，差异基因主要分别与regulating immune effector processes和ROS metabolism相关，提示应对病毒感染的免疫adaptation在早期的progenitor细胞中都存在。而在成熟的G4和G5群，病毒感染触发了细胞因子和分泌基因的产生。
Fig 5 f-h：在细菌感染情况下，中性粒细胞的主要抗菌功能包括synthesis of granular proteins，NADPH oxidase complex，吞噬和趋化都出现了上调。
Thus, during bacterial infection, core neutrophil subpopulations are maintained but genes related to pathogen clearance are upregulated at each stage of neutrophil maturation to maximize host defenses.
6. The ISG-related G5b neutrophil population exists in both humans and mice and expands during infection.
Fig 5b的结果提示E.coli前后G5b的比例出现明显增加。
Fig 6a：作者使用激光扫描流式仪通过共染脾细胞，S100a8和IFIT1来鉴定了G5b细胞（？laser scanning cytometer莫不是质谱成像）。正常情况下，S100a8+中性粒主要分布在红髓，G5b则主要分布在被膜下。
Fig 6b：给了E.coli之后脾脏中性粒细胞总数和比例都增加，G5b细胞的比例和总数也增加。
Fig 6c：尽管大多数中性粒细胞亚群在E.coli之后都出现多种ISG比如Ifitm1的上调，许多G5b特异性表达的ISG比如Isg15和Oas2则没有出现变化。提示ISG-related G5b expansion并不是细菌诱导的ISG表达。
Fig 6d-f：在正常人的外周血中检测了是否存在表达多种ISG的G5b亚群，发现是存在的。
7. Bacterial infection accelerates G1 cell division and post-mitotic maturation without altering overall neutrophil differentiation.
Fig 7a：在细菌感染后，中性粒细胞亚群出现明显扩增。然而，粒细胞分化和成熟轨迹在E. coli-challenged mice基本没有变化。
Fig 7b：control和challenged细胞群之间的转录因子相关性也很好。
Fig 7c d：尽管G1,G2期细胞都在扩增，只有G1细胞的扩增评分是增加的。G1和G2细胞的G2M评分都是高的。而G2的S评分在感染后出现了下降。
在病毒感染时，G3和G4 pool应该增加以产生更多成熟的中性粒细胞。但是C3和G4在细菌感染后比例没有变化(Fig 5b)，提示post-mitotic maturation在BM中就被增强了。
Fig 7e：为了验证这个假设，作者使用EdU标记分裂的细胞并检测了骨髓和外周血中的分裂细胞。通过Ly6G和CXCR4，作者区分了relatively immature (Ly6GlowCXCR4hi), intermediate mature (Ly6GhiCXCR4high)和mature neutrophils (Ly6GhiCXCR4low)，并检测了其中EdU阳性细胞比例。
Fig 7f：在正常小鼠的骨髓中，EdU标记的细胞在2h进入未成熟期，12h进入中度成熟期，48h进入成熟期。每个时期 约持续24h，EdU+在血液和脾脏中大概72h后出现。在细菌感染组，Ly6GhiCXCR4low细胞比例显著下降，Ly6GlowCXCR4hi和Ly6GhiCXCR4high细胞在PB和BM中都很多。这些中性粒的成熟和到达外周组织的模式和正常小鼠基本一致，但是时间从3d缩短到2d，也就是说post-mitotic neutrophil maturation period在感染小鼠显著缩短。
8. Bacterial infection primes neutrophils for augmented functionality without affecting overall heterogeneity.
Fig 8a：细菌感染后，骨髓中G1细胞比例增加，提示髓系祖细胞增殖增加。骨髓G2细胞比例没有变化，提示G1-G2的influx和G2-G3的分化之间的平衡。
Fig 8b：速率分析的结果提示正常状态下G3-G5a的转变在感染后受到抑制。在感染后G3主要分化为G4细胞。前面的数据Fig 5b和Fig 8a也可以看到骨髓中G4细胞下降但是在外周血和脾脏中比例增加。PB G4主要是由BM G3分化而来。此外，病毒感染显著抑制了G5a和G5b向G5c的分化，感染组的G5c细胞比例显著下降。
Fig 8c-d：为了在感染部位探究中性粒的异质性，作者提取了腹腔中性粒。有趣的是，尽管G5c再正常外周血占到25%，在细菌感染后<10%，超过45%的腹腔中性粒都是G5c。提示这群细胞比G5a和G5b具有更强的穿越血管的功能。
Fig 8e：细菌处理后中性粒细胞的凋亡和坏死评分也增加。
Fig 8f：模式图
延伸的一点点思考
关注中性粒细胞的单细胞文章都很少，原因主要还是粒细胞半衰期很短，死亡的比较快。在做各种疾病外周血单细胞测序的时候提外周血PBMC也常常把中性粒细胞丢失掉了。
而且粒细胞和其它免疫细胞相比，基因中位值也要低很多，在粒细胞很多的样本中，就会显得整体样本测得的基因数比较低。在跑CellRanger的时候，粒细胞也常常会因为测得的基因数低被滤掉，因此cellranger还提供了专门的粒细胞处理pipeline。
在这篇文章的supplement中 (下图g)，看Gr1+中性粒的基因数的话，骨髓稍微高一点，脾脏和外周血的Number of genes也非常低，感觉也就在500左右吧。
可以留意一下直接比较同一数据集中不同免疫细胞基因数的图，会更直观一点。