2021-10-09

Science | 基因疗法治疗血友病有望成为标准疗法

原创 灯泡 图灵基因 今天

收录于话题#前沿分子生物学机制

撰文：灯泡

IF= 47.728

推荐度：⭐⭐⭐⭐⭐

亮点：

基因疗法有望实现安全、有效、持久的凝血因子表达，并成为低收入国家治疗血友病的标准疗法。

血友病是一种X染色体连锁先天性出血性疾病，由 F8 或 F9 基因突变导致因子VIII（FVIII：血友病 A）或因子 IX（FIX：血友病 B）不足所致，发病几率为1/5000。这些凝血因子在凝血过程中非常重要，因此，患者会出现关节和体腔自发性或外伤性出血。血友病的治疗主要是通过每隔几天输注凝血因子，将血液中FVIII或FIX浓度维持在1%以上，以防止自发性出血。然而，侵入式输注凝血因子使得患者依从性差，高大30%的使用者出现了FVIII中和抗体，同时患者因输注凝血因子而感染慢性丙型肝炎也是非常常见的。为此研究人员开发出更有效的血友病治疗方法——基因疗法，并希望能从从治疗血友病研究中吸取的经验教训为其他遗传性疾病的基因治疗提供参考。

近日，来自美国匹兹堡大学血液学的RAGNI教授为我们介绍了基因疗法在血友病治疗中的研究进展及未来方向，该文章“Hemophilia as a blueprint for gene therapy”已成功发表于国际顶级期刊《Science》。

在过去的十年中，基因疗法的出现通过模拟缺失的凝血蛋白或抑制抗凝蛋白、增加凝血酶 (FIIa) 的生成来改善止血，而凝血酶 (FIIa) 对于使用或不使用抑制剂的患者来说是形成纤维蛋白凝块所必需的。FDA批准的双特异性单克隆抗体emicizumab通过模拟 FVIII并连接激活的FIX和FX，从而促使凝血酶生成。同时靶向组织因子通路抑制剂（TFPI；凝块形成的主要调节剂）的单克隆抗体，如concizumab，可改善通过防止凝块分解来生成凝血酶。抗凝血酶沉默RNA (siRNA-AT) fitusiran则以剂量依赖性方式改善凝血酶生成，AT活性降低至15%-20%。基因疗法具有出血少、提高生活质量、防止中和抗体形成等优点，目前处于临床评估的有NCT04303559 和 NCT04303572。

尽管基因疗法优势明显，但仍然存在风险，其中最致命的缺点是基因疗法可预防但不治疗出血，因此仍需要凝血因子来治疗急性出血。基因疗法在功能上与凝血因子疗法有所不同，例如，emicizumab不能与带负电荷的磷脂、血小板或血管内皮结合，并且对FIXa 和 FX 的亲和力很弱。而同时使用凝血因子和基因疗法可能会增加动脉和静脉血栓风险，因此对于肥胖、高血压、糖尿病，或有遗传性或获得性血栓形成倾向的患者，是否可以同时使用两种凝血疗法有待进一步研究。

目前，基于腺病毒 (AAV) 载体的基因疗法已被 FDA 和EMA批准用于在体内纠正遗传性视网膜营养不良和脊髓性肌萎缩症。同样基于AAV治疗血友病的临床试验目前已处于后期临床阶段，预计未来1-2年内将有一款血友病基因治疗产品获批。在AAV治疗中，携带 F8或 F9基因的 AAV 载体在肝脏启动子的控制下，通过内吞作用进入肝细胞，并以游离形式存在于肝细胞核中以产生mRNA，随后被翻译成功能性FIX或FVIII蛋白。早期试验发现，在高剂量队列中，AAV表达的FIX约为正常值的5%，持续时间长达10年，FVIII浓度为正常值的10%至70%，持续时间长达5年，同时出血现象和凝血因子的使用减少90%。

然而，AAV基因转移存在潜在风险，包括免疫原性、肝毒性、遗传毒性、插入突变、变异性和有限的持久性。即使在缺乏宿主对载体的免疫应答的情况下，凝血因子表达也可能较低，尤其是使用F8基因治疗时，这可能是因为FVIII通常在肝窦内皮细胞（LSEC）中产生，而不是在肝细胞中产生。

AAV肝基因治疗的另一个潜在风险是插入突变引起的遗传毒性。尽管AAV载体主要是非整合的，但在新生小鼠中观察到AAV相关的肝细胞癌（HCC），AAV整合在HCC肿瘤组织的特定基因组区域。然而，在接受AAV治疗的成年小鼠中，每个细胞的AAV拷贝数较低且没有HCC，这表明接受AAV治疗的新生小鼠中活跃的细胞分裂是HCC的基础，而不是插入突变。；临床中一名患有已知慢性丙型肝炎和乙型肝炎感染（通过供体衍生因子治疗传播）的成人，接受AAV5-hFIX-Padua后，出现了HCC，但在其肿瘤中未检测到载体整合。最终，需要对接受基因治疗的人的肝组织进行直接测序，以确定该高危人群中基因治疗的整合频率和HCC风险。

转基因表达的持久性也是一个挑战，主要是AAV FVIII基因治疗。尽管F9基因受体在长达10年的时间内具有持久的修复反应，且没有下降，但F8基因受体在5年后FVIII表达下降了50%或更大。在慢性丙型肝炎人群中，FVIII表达水平下降可能与高载体剂量、相关肝细胞毒性和内质网应激有关。

那么应该如何解决这些问题呢？一般认为，最佳的血友病基因治疗方法是使用最低剂量的载体、肝脏特异性AAV血清型、肝脏特异性转基因启动子和哺乳动物细胞中生产的载体。此外，儿童的AAV基因治疗受到与器官生长相关的组织增殖的限制，而成人的AAV基因治疗则受到先前存在的中和AAV抗体的限制。与载体疗法相结合的新兴方法包括IgG内肽酶或雷帕霉素纳米粒，以减少先前存在的中和AAV抗体，尽管这些策略仅对低中和抗体滴度（~1:20）有效。对于具有排除基因治疗的抗FVIII抑制剂的患者，可在基因治疗前给予耐受诱导方案，直到达到耐受，然后通过稳定的转基因表达维持耐受，例如使用 CRISPR-Cas9 进行基因编辑的个性化疗法。

为确保开发血友病和其他单基因疾病疗法的最佳疗效和安全性，未来的研究必须集中在载体设计上，以最大限度的减少免疫原性蛋白质、减少宿主免疫反应并避免肝细胞毒性和基因毒性。随着与凝血因子疗法相比的持续进步和越来越多的成本效益证据，基因疗法有望实现安全、有效、持久的凝血因子表达，并成为资源贫乏国家的标准疗法。

作者介绍

MARGARET V.RAGNI，医学博士，美国匹兹堡大学血液学教授。RAGNI博士积极从事、发起、合作并参与先天性止血和血栓形成疾病的临床转化研究。她的研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）的资助，主持或参与主持多项关于恶性血友病（NCI）、血友病抑制剂形成（NHLBI）、血友病HIV/HCV感染（NHLBI）、血友病艾滋病治疗（NIAID）和血友病成人预防（NHLBI）的研究。2016年起担任血液学知名期刊《Blood Advances》副主编，同时发表SCI论文超300篇。

参考文献

MARGARET V.RAGNI.Hemophilia as a blueprint for gene therapy[J].Science, 2021.