黄单胞菌在多种生物膜下的差异基于表达

摘要

众所周知，细菌通常存在于自然形成的多物种生物膜中。在这些生物膜中，物种间的相互作用似乎在生态过程中扮演着重要的角色。对于这些多物种生物膜中物种间相互作用对基因表达的影响，人们知之甚少。本研究对逆转录黄单胞菌转录组在单种生物膜、双种和四种菌群中与根嗜寡养单胞菌、氧化单胞菌和溶淀粉酶Paenibacillus amylolyticus的基因表达进行了比较分析。研究结果揭示了多物种生物膜复杂的相互作用模式。许多受调控的功能与外部环境的相互作用有关，并提示在与其他物种共存时具有较高的表型可塑性。此外，芳香族和支链氨基酸生物合成相关基因表达的变化表明，当这四种生物同时存在于一个生物膜中时，营养互食是观察到的协同生物膜产生的促进因素。

前言

自然生物膜可容纳多个物种，而这些物种之间的相互作用对形成动态群落至关重要。在此之前，我们展示了四种土壤分离的多物种生物膜之间的协同作用，结果与单种生物膜相比，细胞数量和生物膜的形成都没有增加(Ren et al.， 2015)。一个强大的生物膜黄单胞菌,加上Stenotrophomonas rhizophila,小细菌属葡萄糖酸和Paenibacillus amylolyticus尽管他们无能的单一物种生物膜的形成,其他三个菌株是必不可少的强大的协同作用,使这个财团强大的模型为研究multispecies生物膜的相互作用。
这里，我们比较分析了黄单胞在单物种、双物种、四物种生物膜下的基因表达，利用宏转录组的技术发掘在种间相互作用显著影响的基因表达。

结果

转录组文库由X.的单种、双种和四种生物膜(分别为3种、3种和5种复制)与根霉、氧化木霉和淀粉酶(补充材料和方法)联合构建。总共有125Mb的转录本被映射到X. retroflexus基因组的编码序列，样本量在3.16到17.38Mb之间(补充表S1和S2)。确保统计分析是基于一个足够的信号,上面千最丰富的基因,一个映射的至少400记录,测试覆盖率(⩾8.10倍)。约84%的蛋白编码转录组的总碱基对的X.逆转录酶映射到这1000个基因。与X. retroflexus相比，根霉和oxydans的蛋白编码转录本只占总metatranscriptome的一小部分。根瘤菌=10.5±0.6%，平均。而在双物种生物膜样品中，P.淀粉酶转录产物占主导地位(meanP。淀粉酶=68.0±12.4%(图1a)。当这四个物种结合在一起时，根霉和氧化木霉的蛋白质编码转录本的比例在整个跖骨转录组中所占的比例。根瘤菌=10.5±0.6%，平均。而在双物种生物膜样品中，P.淀粉酶转录产物占主导地位(meanP。淀粉酶=68.0±12.4%(图1a)。当这四种植物结合在一起时P。amylolyticus transcriptsdecreased (meanP。amylolyticus = 52.0±4.8%)和生物膜的总量显著增加(图1 a和b)。调查x retroflexus的基因表达,五个复制四个物种生物膜和三个复制的姊妹种生物膜与p amylolyticus创建两个不同的集群在主坐标分析(PCoA)之间的Bray-Curtis不同样品(图1 c)。这些强调了一个非常一致和独特的表达谱的多物种生物膜。

在从土壤中分离的多物种生物膜模型系统上进行了RNA测序实验。 X. retroflexus（Xr）与单个和双物种生物膜的三个重复培养和四个物种生物膜的五个重复培养，分别带有嗜热链球菌（Sr），氧化单胞菌（Mo）和解淀粉假单胞菌（Pa）。 （a）来自五个不同生物膜中四个不同物种的蛋白质编码转录本的平均相对丰度。 （b）相对于最佳单一物种生物膜形成剂（在所有情况下均为X. retroflexus）测得的总生物膜，这24种组合在24小时后形成的总生物膜。 该图基于Ren等人发表的数据。 2015年，利用结晶紫测定法对生物膜进行了定量。 （c）Bray-Curtis基因在单双种和四种生物膜中的逆弯曲杆菌中表达的PCoA差异。 五个点的颜色等于图1b中显示的生物膜组合的彩色条。

当将单物种与双物种和四物种生物膜进行比较时，大约158个基因在至少八倍的表达变化下受到了显着调节（补充材料和方法）。 这些基因的倍数变化显示在图2a中，并支持来自PCoA的观察。 许多上调的基因从解淀粉假单胞菌双物种生物膜逐渐增加到四物种生物膜，这种模式似乎与第一个主要坐标高度相关（图1c和2a）。 共有141个基因在四种生物膜中差异表达，其中有52个基因对该生物膜具有特异性（四种生物中的倍数变化为48，双物种生物膜中的倍数变化为o2）。 在这52个中，只有4个上调，而48个下调。

（a）在单物种生物膜和多物种生物膜中，X。Retroflexus基因表达之间的log2倍数变化（LFC）的热图。分别展示了具有嗜盐链球菌（Sr），氧化单胞菌（Mo），解淀粉假单胞菌（Pa）和四物种生物膜（All）的双物种生物膜，并包括157个具有倍数变化的基因48。内圈显示了四种生物膜中差异表达的上调（蓝色/绿色）和下调（棕色）基因。较深的颜色表示四物种生物膜中独特调控的基因（四物种生物膜中倍数变化为48，双物种生物膜中倍数变化为2）。外圆的大小通过显示基因与PCo1之间的皮尔逊相关性的调整后的P值（Benjamini–Hochberg）的显着性，反映了基因在PCoA样品分离中的贡献（图1c）。树状图表示LCF的分层聚类。 （b）在四种生物膜中差异表达的基因的eggNOG功能分类的李克特图。颜色代码等于图2a。（c）四种生物膜的支链和芳香族氨基酸生物合成途径中的差异调节基因。 α-酮丁酸和丙酮酸都通过相同的酶催化设备用羟乙基-硫胺焦磷酸盐（TPP）进行处理，以合成异亮氨酸或缬氨酸和亮氨酸。观察到的ilvA（苏氨酸脱氨酶）下调表明α-酮丁酸酯合成减少，这使系统远离异亮氨酸途径。 ilvE（支链氨基酸氨基转移酶）的上调可能表明缬氨酸和亮氨酸产生的增加。芳香族氨基酸的生物合成通过分支酸的产生而开始。 trpE（邻氨基苯甲酸合酶组分I）和trpB（色氨酸合酶β链）的下调表明，分支酸向邻氨基苯甲酸的转化率较低，并且色氨酸合成的最后一步降低，导致色氨酸水平降低。 trpG（邻氨基苯甲酸合酶成分II）和trpA（色氨酸合酶α链）的转录物的丰度太低，无法给出明显的信号。相对于单一物种生物膜的LFC如图2a所示在单行热图中显示。标有“＃”的基因在前1000个最丰富的转录本中，这些转录本经过了差异表达测试。

为了全面了解四种生物膜中功能的变化，将141个响应基因标注到eggNOG官能团上，图2b说明了类别中的分布（补充表S3； Powell等，2014）。 在注释为“氨基”的12个基因中酸代谢和运输”，其中两个专门与支链氨基酸合成有关，另外两个与色氨酸合成有关。 ilvA（苏氨酸脱氨酶）的下调和ilvE（支链氨基酸氨基转移酶）的上调表明，α-酮丁酸的产生减少，异亮氨酸的产生减少，并且当所有四个物种都存在时，转移到缬氨酸和亮氨酸合成的途径（图2c） ； Levinthal等，1973）。
Chorismate是芳香族氨基酸的常见前体。trpE（邻氨基苯甲酸合酶I）和trpB（色氨酸合酶β链）的下调表明，色氨酸途径的优先级较低（图2c）。 与色氨酸分解代谢有关的基因（kynU犬尿氨酸酶）的独特下调进一步支持了这种优先排序。 eggNOG功能类别中的其余七个基因被标注为模棱两可的功能或被证明难以解释（补充表S3）。
调节了十个编码转录因子的基因，两个趋化性基因，与细胞膜和细胞壁相关的基因，21个转运蛋白，外排泵和信号转导功能，表明对环境变化具有积极反应（Phelan等，2011）。

讨论

这项研究比较了在单菌，双菌和四菌生物膜中与S. rhizophila，M结合生长的X. retroflexus的转录谱。 oxydans和解淀粉假单胞菌。 当参与四个物种的生物膜时，出现了反屈线虫的独特表达模式，这与三种菌株单独观察到的变化的总和不同。 这表明复杂的物种间相互作用在全球基因表达中引起独特而一致的变化，反映了这种多物种群落的新兴行为。
与其他双物种生物膜相比，解淀粉假单胞菌在逆反射小球藻中诱导了最大的表达反应，并占总蛋白编码转录本的较大部分。即使在双物种培养中由解淀粉假单胞菌诱导的基因在四物种生物膜中始终上调，但是在双物种培养中较高的生物膜产量方面未观察到协同作用。
在这四种生物膜中共调节了141个基因，其中许多功能可能与与外部环境的相互作用有关，并表明对其他物种的存在具有很高的表型可塑性（Frias-Lopez和Duran-Pinedo 2012； Sztajer等，2014）。 仅在四种生物膜中调控至少52个基因，它们代表着各种各样的功能。 多数（48）受到独特的下调，这可能意味着多物种生物膜中的生活方式使X. retroflexus降低了对单一养殖中至关重要的功能的优先级。 该假设得到昂贵氨基酸的生物合成中观察到的基因调控的支持，并表明多物种生物膜中的同居者可能共享能量消耗途径的产物。 这种分工已显示出总体上更高的适应性（Schink，2002； Poltak和Cooper，2011； Pande等人，2014，2015）。
总体而言，结果表明，对多种生物膜中种间相互作用的基因表达反应非常复杂。 对代谢组和基因敲除实验的进一步分析，尤其是针对氨基酸生物合成途径的分析，将导致人们进一步了解所观察到的协同生物膜产生的分子机制（Ren等人，2015）。