三十六策 第 12 策 革故鼎新

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筛、猜 几个分子，表型验证一下，按照套路把表达差异、一正一反、细胞动物一做

查 lncRNA 序列也有一个权威数据库叫 [noncode](file:///Users/gaoyuan/Desktop/%E4%B8%89%E5%8D%81%E5%85%AD%E7%AD%96/www.noncode.org)，在做研究的时候就要先进行序列分析，证明它不编码蛋白

ORF 开放阅读框：从起始密码子开始到终止密码子，一段连续能编码氨基酸的核酸序列，（分辨一段序列是不是非编码，就是看它有没有超过 100 个碱基长度的 ORF）

还有一种分析非编码 RNA 序列特性的工具叫 CSF密码子替换频率，主要是看一段序列编码的密码子在不同物种之间的保守性。当 CSF 评分小于 0 的时候，就可以认为他是一个非编码

研究 lncRNA 的前置动作也是筛猜分子

找一些有过报道的 lncRNA 分子，序列，引物，siRNA 都是现成的，把所有的关注点聚焦到分子是不是有新表型上。

lncRNA命名混乱

反义 AS： 反义是一类从编码基因反向转录的 lncRNA

内含子 IT： 在基因内含子区域编码的 lncRNA。

重叠 OT：是跨越内含子和外显子的 lncRNA。

长链基因间 lncRNA lincRNA，都是以大写 LINC 为前缀数字为后缀，编码区域位于两个基因中间，不与编码基因的内含子和外显子重叠。

与编码基因是头对头挨着，推断有双向启动子，这些 lncRNA 用反义上游 AU做后缀

eRNA，是由基因的增强子编码产生的，作用是促进基因转录。

circRNA 是由特殊可变剪切产生的，主要存在于细胞质中，大部分来源于外显子，少部分内含子来源的 circRNA 存在细胞核中。circRNA 因为呈闭合环状结构，不易被核酸外切酶降解， 比线性 RNA 更加稳定。circRNA 的表达水平具有种属、组织、时间特异性，序列保守性比一般的线性 lncRNA 高。

筛分子，找序列，基础表达，操作工具，细胞表型， 动物表型和 Rescue。

第一步，检测基础表达做 RNA 水平检测，实时定量 RT-PCR。 还可以FISH，荧光原位杂交

第二步，制备基因操作工具，核定位的 lncRNA 用 RNAi 做可能效果是很差，CRISPR 基因编辑技术直接把 lncRNA 的基因给 knockout 掉

第三步，细胞表型实验

第四步，动物表型实验

第五步，表型的 Rescue 实验，把 CRISPR 敲掉后的细胞再过表达 lncRNA 分子进去。

因为一正一反的两次操作被合并到一个实验里观察，其他的干扰因素都没有，只有观察到分子上调或下调后表型出现或失去，这种因果关系的证明就更强了。单变量的 Rescue 实验可以替代一正一反，但是一正一反两个实验不能替代 Rescue。

功能基因的 Rescue 利用密码子的简并性导入一个突变过表达载体， 可以使得过表达和 siRNA 干扰这两个操作相互独立。序列人为突变之后，让蛋白的氨基酸序列保持不变，而 mRNA 序列可以发生改变，变得 siRNA 结合不上也就阻断不了了。这样的 rescue 效果是分子介导的功能表型之间发生抵消作用，而不是 siRNA 跟过表达载体的相互结合、无效化。

miRNA 作用于靶基因 mRNA 的 3’UTR，但是做下游靶基因的过表达的时候，只需要把 ORF 开放阅读框克隆到载体里面，不加 3’-UTR，转进入的 Rescue 载体不受 miRNA 过表达的影响。如果表型回复成功了，就说明 miRNA 的表达和表型的关联是依赖于这个靶蛋白变化的。如果表型没变化，那就说明 miRNA 介导表型不是靠这个蛋白。

Rescue 就是这样一种证明一个分子发挥功能依赖于另一个分子的实验策略

lncRNA，circRNA 的作用机制

第一，它可以作为 miRNA 分子海绵，像海绵一样吸引结合 miRNA。

第二，它可以调控基因转录，跟转录因子关系密切。

第三，编码小肽。