The emerging complexity of gene fusions in cancer

Corresponding author: Felix Mitelman
Director, University of Melbourne Centre for Cancer Research at University of Melbourne
Professor of Clinical Genetics in Lund, Sweden

Guided gene fusion detection

• Cytogenetic data.
  
  Major discoveries from research on gene fusions and cancer. Since the Philadelphia chromosome was discovered in 1960 as a specific chromosome change in chronic myeloid leukaemia (CML), studies over the past six decades have identified fusion genes in a multitude of other neoplasias and through many different approaches.
  
  The first gene fusions were discovered in the early 1980s。
  The first balanced rearrangements were reported in 1973，即费城染色体（指22号染色体长臂与9号染色体发生易位形成新的染色体。表现为22号染色体长臂区段易位至9号染色体长臂上，致使基因BCR和ABL融合，在大部分CML，部分ALL及少数（急性髓细胞白血病）可见。

The chromosomal basis of gene fusions. a. Balanced changes包括易位、插入和倒置，unbalanced change是缺失，相互易位会产生两个衍生染色体，每一个都可能含有致病基因融合; b. 染色体重排的另一个可能结果是基因A或基因B被截断，导致单倍体功能不全或显性阴性亚型，互交换可能导致两个融合基因，A-B和B-A，但通常只有其中一个基因将产生一个in-frame fusion transcript。

• Fluorescence in situ hybridization.
  ISH（荧光原位杂交技术）作为一项很重要的遗传学检测技术，在血液肿瘤的诊断中有很大的作用，得到了NCCN等国内外各大血液肿瘤诊疗指南的认可和建议。FISH可用于血液肿瘤相关的基因融合、断裂、缺失、扩增以及染色体整体数量异常的检测。
• High-throughput array-based analyses.
  虽然细胞遗传学数据对基因融合的检测无疑是至关重要的，但这种方法存在一些重要的缺陷。首先，染色体条带分析需要几乎是活细胞，这就需要将肿瘤样本快速运送到实验室，在那里可以进行细胞培养；其次，许多肿瘤细胞难以在体外培养，限制了对中期细胞的条带分析；第三，一些肿瘤类型，尤其是高度恶性的肿瘤，往往有非常复杂的基因组，这使得很难从噪音中分辨出原发的、致病基因上重要的畸变，或将重新排列分配给特定的染色体带。因此，基因融合检测偏向应用于血液病肿瘤。
  芯片分析不需要对细胞进行培养
  芯片可以检测到两个位于同一染色体带的基因的染色体重排，但无法通过染色体带分析检测到的

Unbiased gene fusion detection

随着DNA测序和转录组测序的推进，近几年来，检测到了越来越多的融合基因。尤其是2015年，TCGA项目组的Yoshihara and co-workers 通过对来自13种肿瘤的4,366个肿瘤样本进行研究，发现了约8,600 个不同的融合转录本。截至目前（2014年），约有10,000个基因融合被发现，超过 90% 是近五年通过测序技术发现的。

The number of new gene fusions reported each year from 1982 to 2014 is shown. Unbiased gene fusions are those detected by deep sequencing, whereas guided gene fusions represent those identified as the result of molecular analyses directed by prior (cyto)genetic information.

高通量测序技术有两个特点：1. deep sequencing enables the detection of fusions that arise through types of rearrangement other than exchanges of large chromosome segments detectable by banding analysis，因此染色体内部的重排也可以被检测到。实际上，75%通过测序发现的基因融合发生于同一条染色体内部，其中50%落在同一个染色体区段内；2. the picture that emerges for the gene fusions that have been detected by deep sequencing is distinctly different from that detected through guided approaches, which identified few promiscuous genes and networks. Instead, the vast majority of genes involved in the new fusions are, so far, linked to only one other gene 测序获得的融合基因与之前方法获得的大不同（见下图）。

Of the 379 currently known fusions in ovarian cancer, only two were first detected by guided approaches, with 377 first detected by deep sequencing. In sharp contrast to the picture in acute myeloid leukaemia , only four genes recombine with at least three partners. Furthermore, there are few interconnected networks, with 292 (77%) of the fusions not being part of any kind of network.

深度测序目前也面临着一些困境：一方面，深度测序是高度敏感的，也就是说允许发现罕见事件，但是,另一方面，它也是易于出现错误结果的。由于参考基因组装配中的错误或基因之间广泛的序列相似性，在测序之前(即在库准备期间)或在分析获得的序列时，可能已经引入了错误，或在生物信息学水平上引入了错误。不同检测融合转录本的算法在敏感性和特异性方面有很大的差异，这取决于指定特定序列是否为嵌合时使用的不同标准。RNA测序也会导致假阴性，首先，次优的RNA质量会降低读取的数量和质量，从而降低检测融合转录本的机会；例如，很少有研究将RNA-seq用于福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织，因为从这些样本中提取的RNA通常高度降解，并经过化学修饰。其次，低水平表达的基因融合或导致基因转录沉默的基因融合可能很难或实际上不可能检测到，同样的情况也适用于一些亚克隆融合事件。第三，由于没有嵌合的mrna，导致启动子元件交换以及随后两个基因之一的完整编码序列的转录上调的染色体重排可能无法被检测到。上述许多问题可以通过将RNA-seq与全基因组DNA测序相结合来解决。
然而，关于深度测序结果的一些问题是基于RNA的分析所特有的，不能通过在DNA水平上进行验证性研究来解决。例如，选择性剪接可能涉及多个基因，导致所谓的转录诱导基因融合(TIGFs)，尽管许多顺式TIGFs在体内可能代表随机事件，对细胞功能几乎没有或几乎没有影响，已经发现一些顺式TIGFs具有组织特异性，与特定的肿瘤类型相关，这表明一些TIGFs可能对肿瘤的发展很重要。

Pathogenetic impact of gene fusions

• Transcriptional deregulation 转录调控失常
  human cancers could be the result of genetic transpositions, with translocations and other chromosome rearrangements leading to the abnormal expression of otherwise normal cellular genes located at breakpoints
• Chimeric genes 嵌合基因
  通过重组由来源与功能不同的基因序列剪接而形成的杂合基因。
• Gene truncations
  基因的截断，导致肿瘤抑制基因的失活。In fact, in a recent study by TCGA, which carried out RNA-seq analysis of 179 AML samples, a total of 118 in-frame gene fusions were detected in 80 samples, with an additional 42 gene fusions being out-of-frame, creating a truncated upstream gene or potential haploinsufficiency for both partner genes。
• Passenger mutations
  目前已被描述的近10,000个基因融合中，大多数可能是对肿瘤发生几乎或没有影响的乘客突变。因此，有人建议，用于基因融合检测的算法不仅要考虑支持某种融合的读数和质量等指标，还要考虑所涉及的两个基因的性质(结构特征、序列基序等)。另外，许多通过深度测序检测到的融合转录本是许多恶性肿瘤的遗传不稳定性的结局而不是原因。

Clinical relevance of gene fusions

复发性基因融合与肿瘤亚型之间的强相关性使其成为理想的诊断目标。对于常见的肿瘤类型，如前列腺癌，也有人认为基因融合检测可能有助于筛查目的。由于一些形态相同的恶性肿瘤在基因融合状态上是异质性的，而基因融合状态反过来又反映在患者的预后中，因此它们对治疗分层也很重要。目前，这一策略主要用于血液病的临床应用，但在检测和富集循环癌细胞和DNA方面的快速进展表明，含有基因融合的实体肿瘤也可能以类似的方式进行监测。应该强调的是，在诊断中检测到的基因融合不一定必须具有重要的致病性才能对监测有用，只要它们在肿瘤细胞中具有代表性和特异性。
基因融合的一个重要贡献时药物的开发。2011年美国FDA通过了酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼，这通过阻断激酶（融合蛋白:bcr - abl）活性，治疗CML。

Conclusions

30多年来，基因融合被认为是肿瘤发生的驱动突变，从这些研究中获得的发现有助于我们对致癌过程的理解。然而，最近在深度测序技术方面的进展表明，基因融合比之前猜测的要普遍得多。事实上，仅在过去的3年里，就有超过9000个新的基因融合被发现，而其作用大多仍有待阐明。这些融合蛋白中的绝大多数可能代表的偶然事件很少或没有致病性。然而，考虑到通过对单个融合体(如BCR-ABL1)的详细研究，这些融合体的进一步功能表征以及寻找新的融合体应该是一个重要的研究课题。即使某些融合蛋白，或大多数融合蛋白，最终被证明不是是治疗靶点，更详细地了解它们是如何被调控的，它们影响哪些下游靶点，以及它们干预哪些细胞过程，也将为寻找新的肿瘤治疗方法提供重要线索。