细胞污染及预防

由于环境条件没有控制好和操作不当等原因,细胞培养中常可发生细菌和霉菌的污染。

常见污染的细菌有:革兰氏阴性菌,如大肠埃希菌、枯草杆菌、假单胞菌等;革兰氏阳性菌有葡萄球菌等。真菌污染在炎热潮湿的季节常可发生,如烟曲霉菌、黑曲霉、毛霉菌、孢子苗等。霉菌和细菌生长迅速,能在短时间内抑制细胞生长或杀死细胞,镜下可见胞浆内出现大量颗粒,细胞变圆或崩溃从壁上脱落。对于污染的观察,霉菌污染易于发现,肉眼可见白色或浅黄色菌团漂浮于培养液表面,有的散在生长,镜下可见丝状菌丝,纵横交错于细胞之间。而细菌污染较重时可见培养基上清浑浊,较轻时镜下可见小的菌体在细胞间运动,同时可涂片染色镜检或进行培养及培养加以确定。

目前细胞培养过程中最主要的问题就是污染,污染可导致细胞的死亡,使其作为科研的原料不可再用,造成人力、财力和实践的损失,因此一定要尽量避免污染的发生。一般可从以下三个途径来控制污染的发生:

一. 细胞培养的室内环境 

 细胞培养室内应相对封闭,洁净无尘,设有缓冲间。细胞培养间配备枪式移液器、手术器械、离心机、冰箱等专用仪器设备以及专用的实验服和拖鞋,定期消毒。专用物品只在培养间内使用,不得带出培养间。培养间和缓冲间每周彻底清洁消毒一次。

二. 细胞培养的试剂和用品  

工作中要特别注意防止培养液和血清的污染。培养细胞所用的血清必须储存于-20至-70℃,但也不能超过一个月,解冻时在4℃冰箱溶解一天,至室温下全溶后再分装,在溶解过程中要规则摇晃均匀,使温度与成分均一,这样可以减少沉淀。最好不要直接在37℃解冻,因温度改变太大,容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。

三. 无菌操作和对实验人员的要求 

有很多污染的发生都与操作不当有关,而细胞培养试验的操作应是严格的无菌操作。首先试验进行前,无菌操作台面、废液缸及实验用品均应用紫外灯照射30-60分钟灭菌;以75%酒精擦拭无菌操作台面,并开启无菌操作台风扇运转10分钟后方可开始实验操作。在无菌操作台进行实验前须戴一次性乳胶手套,并用75%酒精擦拭。

实验用品及试剂瓶应以75%酒精擦拭后才能带入无菌操作台内。实验操作应在台面的中央无菌区域;不能在打开的容器的正上方操作实验;移液时吸量管口不要触碰细胞培养皿;试剂瓶及培养瓶关盖时要先在酒精灯上转圈灼烧瓶口片刻,以防止试剂的污染。在培养超过一种的细胞时,还要防止不同细胞间的交叉污染。

对实验人员的要求:实验人员进培养间之前,须先洗手,在缓冲间换穿专用实验服和拖鞋,准备好与细胞培养操作实验有关的所有试剂和用品,严禁在实验进行时频繁出入培养间。要求实验人员规范操作,严格遵守无菌工作流程。做完实验后应将实验产生的废物和废液及时移出培养间,并清洁无菌工作台面。

细胞培养中最常见最难发现的一种污染是支原体污染,针对支源体污染,海星生物推出的支必清支原体清除试剂盒,经验证,可有效去除莱氏无胆甾原体(Acholeplasmalaidlawii)、精氨酸支原体(Mycoplasmaarginini)、猪鼻支原体(Mycoplasmahyorhinis)和口腔支原体(Mycoplasmaorale)等支原体。在动物细胞培养中,这些支原体菌株占污染的85%以上。支原体污染验证的细胞株常会出现大量黑色颗粒,称为黑胶虫。

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