2022-01-14

Nat Biotech | DNA甲基化时钟精准追踪干细胞谱系

原创 旧岛望月亮 图灵基因 2022-01-14 09:24

收录于话题#前沿分子生物学技术

撰文：旧岛望月亮

IF=54.901

推荐度：⭐⭐⭐⭐⭐

亮点：

1.突破了传统谱系追踪对大量个体信息的依赖，有助于在干细胞动态变化过程中区分个体内和个体间的异质性。

2.开发了波动甲基化时钟，分析了不同组织干细胞的平均数量和替换率。

3.将该技术成功运用于检测、区分急性和慢性白血病，为研究人类体细胞进化提供有效手段。

2022年1月3日伦敦玛丽女王大学Trevor A. Graham等人在《Nat Biotech》上发表了名为”Fluctuating methylation clocks for cell lineage tracing at high temporal resolution in human tissues” 的文章。作者利用甲基化阵列识别了内源性的波动CpG位点(fluctuating CpG, fCpG)，并开发了一套数学模型定量测量人成体干细胞的变化。这种具有高时间分辨率的波动甲基化时钟(fluctuating methylationclocks, FMCs)能精确测量人类体细胞的出生和死亡。

单个人类细胞的命运很难重构，动物模型中通常使用转基因或外源细胞标记法直接进行克隆谱系追踪，但这些方法很难运用于人体。人类研究需要使用体细胞基因组突变，即“分子钟”技术，来追踪体细胞的命运。其基本原理是相关程度高的细胞共有多个基因突变位点，而相关程度低的细胞几乎没有共同的基因突变。因此包括线粒体DNA突变、中性位点的DNA甲基化，杂合性位点的等位基因丢失在内的各类体细胞基因突变已被用于人体组织的谱系追踪。大多数分子钟通过计算出生以来的突变累积推断细胞谱系，而这种方法只能揭示长时间的克隆动态变化。计算突变累积速率能够揭示短时或最近的克隆动态变化，但在实践中会受到“饱和”的影响，即不同的克隆群体会趋近于相同的突变演化模式。

研究表明在特定条件下某些CpG位点上的DNA甲基化会发生规律性变化，包括干细胞全能性丧失。因此，作者首先假设在二倍体细胞中某些CpG位点的DNA甲基化比例在0%(纯合未甲基化)、50%(杂合甲基化)和100%(纯合甲基化)之间会发生随机地、可测量地波动(图1a和1b)。当这种波动以几十年为一个周期时，就可以利用fCpG来推断现有细胞群体的周期性动态变化。利用 Illumina EPIC序列对结肠隐窝的fCpG基因位点的甲基化水平进行检测，发现其平均比例约为50%。而在单个隐窝中甲基化水平呈特异的三峰W型分布，这与最近的共同祖先的甲基化模式相类似(图1d)。

接着，作者设想fCpG甲基化β值(甲基化等位基因比例)的分布形态是由细胞进化的动态变化所决定。为了验证这一假设，作者开发了一套数学模型和相应的贝叶斯推理方法将隐窝干细胞的竞争性动态变化与测量到的fCpG甲基化分布联系起来。该数学模型由隐马尔可夫模型组成，后者描述了一定大小的干细胞中单个CpG位点甲基化和非甲基化拷贝数的时间依赖概率分布。作者假设了三种给定的CpG位点甲基化状态改变的过程(图1c)，分别是自发甲基化(恒定速度为μ/等位基因·年)；自发去甲基化(恒定速度为γ/等位基因·年)；一个干细胞替换另一个干细胞(恒定速度为λ/等位基因·年)。而贝叶斯推理法能同时推断干细胞数量、每个干细胞的替换率(λ)以及甲基化(μ)和去甲基化(γ)速率，从而能够在考虑个体内和个体间异质性的同时研究特定组织的干细胞动态变化。

为了验证上述方法，作者生成了三个“合成”隐窝，每个隐窝包含五个干细胞，平均替换率为1个/干细胞·年，(去)甲基化事件率分别为0.0005、0.05或0.5/等位基因·年(图2a)。中等(去)甲基化速率下，隐窝的FMC分布与单个隐窝数据中所观察到的W型分布相同。在低(去)甲基化速率下，甲基化分布基本上集中在0%和100%附近，少数fCpG基因位点处于50%的甲基化状态。而高(去)甲基化速率下，甲基化分布接近以50%为中心的二项式分布。因此，当模拟的(去)甲基化速率适度时，该模型能够准确地恢复所有已知的参数值，并具有良好的置信度(图2b和2c)。之后作者利用硅胶隐窝模型也证明了数学模型和推理方法的可行性(图2d)。

运用FMC法测量人结肠和小肠隐窝干细胞的动态变化，发现正常结肠样本中有5.8±1.7个干细胞，小肠腺中有6.5±1.0个干细胞(图3b)。正常结肠的替代率为1.1±0.8个/干细胞·年，小肠的替代率降至0.79±0.5个/干细胞·年(图3c)。利用分层贝叶斯广义线性模型(GLM)，发现小肠腺有更多的干细胞(图3d)，但每个干细胞的替换率比结肠低(图3e)。因此，在结肠和小肠中每个隐窝的替换总数没有显著差异(图3f)。患有家族性腺瘤性息肉病(FAP)的个体携带APC基因的杂合胚系突变。APC作为Wnt信号的关键调节因子，该位点的致病性突变会使个体患结直肠癌的风险增加。作者推测患有FAP的个体的干细胞动力学可能发生了改变，结果表明FAP隐窝与非FAP结肠中的干细胞数量相似，但干细胞替换率显著增加(图3a和3c)，使得FAP患者每个隐窝的替换总数显著增加(图3f)。

之后，作者在人体全血中寻找类似的FMCS。与肠道相似，在正常多克隆血液样本中单个细胞CpG基因位点的平均甲基化水平在50%左右。相同个体10年前后的数据表明血液样本的变化相对稳定，然而随着年龄的增加有微小但显著的增长(图4b)，在整个年龄阶段中也可以观察到这种现象(图4a)。血液中的克隆性造血是肿瘤演化的早期阶段。由于克隆细胞最初会共享祖细胞的甲基化模式，该阶段将会使得突变增加。因此作者推断急性白血病会出现与隐窝相似的W型分布。实验结果表明不同类型的造血系统肿瘤全血样本比正常样本的变异更高，其中急性淋巴细胞白血病(ALL)和急性髓系白血病(AML)的突变呈W型分布(图4c)。最后作者通过模拟造血过程研究FMC对全血克隆的检测作用，结果显示多克隆全血变异很低，并随着时间推移保持稳定。急性白血病的血液变异水平迅速升高，并在两年内产生了W型分布。慢性贫血病比正常血液有更高的变异但缺乏W型分布，而不确定潜能的克隆性造血( clonal hematopoiesis of indeterminate potential, CHIP)的变异同正常全血中衰老造成的变异相似(图4d)。作者据此推测，与年龄相关的fCpG变异增加的趋势反映了老年人CHIP发病率的升高。

尽管结肠与小肠具有相似数量的隐窝，并在衰老过程中积累了相似数量的突变，结肠癌是人类第四大常见癌症，而小肠癌的发病率要比它低14到50倍。根据“坏运气假说”，癌症发病率的差异可以用两种组织中干细胞动力学的差异来解释，而作者的研究也为该解释提供了依据。此外作者表示，甲基化阵列的局限在于需要从少量的样本中获得高质量的DNA，并且数学模型所依据假设的有效性会影响测量的准确性。

教授介绍

Trevor A.Graham为伦敦玛丽女王大学肿瘤进化学教授，2009年获伦敦大学学院数学生物学博士学位。研究方向主要是癌症预防、癌症筛查和早期诊断、癌症遗传学、靶向肿瘤细胞、靶向肿瘤微环境等。他的课题组致力于通过描述肿瘤的进化特征，从而找到更好的预后方法和更有效癌症治疗方法。其团队开发的针对癌症相关整合素avb6的新型放射性示踪剂，已进入纤维化和癌症的临床试验阶段。

参考文献

Gabbutt C, Schenck RO, Weisenberger DJ, etal. Fluctuating methylation clocks for cell lineage tracing at high temporalresolution in human tissues. Nat Biotechnol (2022).