Sci Adv | 工程化中性粒细胞外泌体囊泡靶向治疗肿瘤
原创 苏安 图灵基因 2022-01-27 09:23
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撰文：苏安
IF：14.136
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亮点：
中性粒细胞是人类循环中最丰富的先天免疫细胞；然而，它们衍生的外泌体很少被研究用于肿瘤治疗。作者研究了来自中性粒细胞的外泌体(N-Ex)通过传递细胞毒性蛋白和激活caspase信号通路来诱导肿瘤细胞凋亡。此外，他们的团队用超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPIONs)修饰N-Ex，并获得了更高的肿瘤靶向治疗效果，并从中性粒细胞中制备了高产的外泌体样纳米囊泡(NNVs)。与载脂质体阿霉素(DOX)和天然NNVs相比，载DOXNNVs对肿瘤细胞增殖有更好的抑制作用。此外，在外磁场下，dox负载、SPION修饰的NNVs选择性地聚集在肿瘤部位，能够有效抑制肿瘤生长，广泛延长小鼠的存活率。总而言之，本文的研究团队开发了一种简单有效的N-Ex和NNVs的临床应用工程方法，为肿瘤的靶向治疗提供了高效、安全的载药途径。
中性粒细胞（Neutrophils）是人体循环中最丰富的先天免疫细胞，是抵御感染的第一道防线。中性粒细胞可以通过对肿瘤细胞的直接细胞毒性作用、抗体依赖性细胞毒作用和募集其他抗肿瘤效应细胞来消除恶性肿瘤细胞。此外，中性粒细胞可以释放细胞毒性底物介导对肿瘤细胞的杀伤，可以激活凋亡信号通路，直接促进肿瘤细胞死亡，还能够产生广谱抑制肿瘤细胞增殖的因子。
外泌体（exosome），是细胞分泌产生的一种囊泡型天然生物颗粒，在细胞间发挥通讯作用。最近的研究显示，来自免疫细胞的外泌体具有与其产生细胞相似的有效抗肿瘤活性。之前也有研究使用中性粒细胞来源的外泌体（N-Ex）来治疗关节炎和败血症。然而N-Ex在癌症治疗中的作用尚未得到充分探索，这主要是由于中性粒细胞半衰期短，且其外泌体产量低。
化疗是治疗肿瘤的一种常用方法，但大多数化疗药物缺乏肿瘤靶向能力，对正常细胞有毒性作用。生物相容性、可生物降解性和低毒性的特点可以让外泌体作为提供化疗药物的一种新工具。此外，外泌体从其产生细胞继承自然靶向性，并在全身输注后在局部和转移性肿瘤部位积累，还可以逃脱宿主免疫系统的清除，并通过生理屏障。这些优点已经让外泌体纳米囊泡（NVS）成为一种高效的外泌体样药物传递系统。但来自中性粒细胞的NVs(NNVs)是否可以用于癌症治疗尚不清楚。
近期，在Science Advance杂志上发表了一篇名为“Engineered neutrophil-derived exosome-like vesicles for targeted cancer therapy”的文章，本文的研究团队证实了N-Ex通过激活细胞凋亡信号通路发挥了显著的抗肿瘤作用，并且用超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPIONs)修饰N-Ex，用于靶向癌症治疗。此外，他们用挤压法制备了装载阿霉素(NNV-DOX)的NNVs，并用SPION(NNV-DOX)对其进行修饰，以实现双靶向性和联合抗肿瘤反应。他们的研究表明，工程化SPIONNNVs在靶向药物传递和癌症治疗方面非常强大，它可以高产地用于临床转化。总之，研究团队开发了一种简单、快速的方法用于制备中性粒细胞纳米囊泡，与天然外泌体相比，中性粒细胞纳米囊泡具有与天然外泌体类似结构、生物组成和功能等，可作为一种安全有效的药物递送平台用于肿瘤靶向治疗。
为了产生中性粒细胞外泌体（N-Ex），研究人员从健康献血者的外周血中分离中性粒细胞，并将其在无外泌体培养基中培养24h。采用超离心法从中性粒细胞条件培养基中分离出N-Ex，并通过密度梯度离心法进行纯化。用透射镜测量N-Ex的囊泡结构。N-Ex呈杯状形态，直径为30~150nm。N-Ex的原子力显微镜(AFM)图像显示典型的外泌体椭圆形结构，在斜视图的三维成像中显示N-Ex的模式。此外，纳米颗粒跟踪分析(NTA)结果显示，N-Ex的平均直径为125±10nm，−26±电位为zeta1mV，这与TEM形貌一致。通过动态光散射(DLS)检测N-Ex的多分散性指数(PDI)，其值低于0.3。通过Westernblot进一步鉴定证实N-Ex表达外泌体标记物CD9、CD63、CD81和Alix，但不表达内质网(ER)标记物calnexin。这些结果表明，外泌体已成功地从人类中性粒细胞中分离出来。为了确定N-Ex是否能被肿瘤细胞吸收，我们用碘化物(DiR)荧光染料标记N-Ex，并与HGC27、SW480和HepG2细胞孵育不同时间。流式细胞术和荧光共聚焦激光显微镜成像结果显示，N-Ex以时间依赖的方式有效地内化到肿瘤细胞中。图1.N-ex的分离、鉴定和摄取
接下来，为了确定N-ex在体外的抗肿瘤活性，研究人员采用细胞计数Kit-8(CCK-8)实验来确定N-Ex对肿瘤细胞(HGC27、SW480和HepG2)和正常细胞(GES-1、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人成纤维细胞(HFL))增殖的影响。他们选择40ug/ml作为工作剂量，因为该浓度对正常细胞增殖的增殖影响很小，但对肿瘤细胞的抑制有稳定和有效的作用。与对照组相比，N-Ex显著抑制了HGC27细胞的增殖能力。流式细胞显示，N-Ex在治疗24小时后诱导肿瘤细胞凋亡，而正常细胞没有凋亡。染色结果显示，N-Ex处理后，肿瘤细胞线粒体膜电位明显升高。用N-Ex(40ug/ml)处理24小时的HGC27细胞，检测其细胞凋亡信号通路蛋白的状态，Westernblot结果显示，N-Ex处理增加了HGC27细胞中caspase-3、caspase-7的表达水平。综上所述，N-Ex通过激活细胞凋亡信号通路在体外抑制肿瘤细胞活力。
为了确定N-ex在体内的抗肿瘤活性，研究人员将HGC27细胞皮下注射到BALB/c裸鼠中，并生成异种移植瘤模型，以评估N-Ex的体内抗肿瘤疗效。结果显示，N-Ex治疗组对肿瘤生长有显著的抑制作用。N-Ex处理小鼠的平均肿瘤体积保持在<500mm3，而小鼠的体重没有明显减少。通过Westernblot检测肿瘤中凋亡相关蛋白的表达。结果显示，N-Ex治疗通过激活肿瘤中的caspase信号通路，可显著促进细胞凋亡。并且苏木精和伊红（H&E）染色结果显示，N-Ex治疗未引起主要器官（心脏、肝、脾、肺、肾）的细胞变性或坏死，说明N-Ex无明显的全身毒性。综上所述，N-Ex在体内具有有效、安全的抗肿瘤作用。图2.N-Ex在体内外均表现出抑瘤活性。
考虑到给药的N-Ex在肝脏和脾脏中的保留可能会阻碍其治疗效果，研究人员通过转铁蛋白(Tf)-转铁蛋白受体(TfR)相互作用，用SPIONs修饰N-Ex，以提高其肿瘤靶向能力。他们将TF-SPION与N-CM在外部磁场下孵育，制备SPION偶联的N-Ex(SPION-Ex）。该方法提高了N-Ex的分离效率，并保持了N-Ex在PBS和血清中的良好分散度。透射电镜检测纯化后的SPION-Ex，透射电镜图像显示，球形外泌体被多个超顺磁性纳米颗粒包围。SPION-Ex的平均尺寸和zeta电位分别为140±11nm和−34±1mV。此外，SPION-Ex表现出良好的多分散性，PDI低于0.3。Westernblot结果证实了SPION-Ex中外泌体标记物的存在、TfR的富集和钙连接蛋白的缺失。纯化后的SPION-Ex用DiR标记，并与HGC27细胞孵育24小时。采用荧光共聚焦激光显微镜和流式细胞术来观察SPION-Ex的细胞内定位。如图所示，在外部磁场下与dir标记的SPION-Ex孵育时，细胞质中观察到更强的荧光信号（红色），说明SPION修饰改善了受体细胞对N-Ex的摄取。总之，研究人员开发了一个基于SPION的快速分离和纯化N-Ex的系统。图3.SPION-Ex的磁分离和表征。
随后，研究人员评估了SPION-Ex的体外靶向能力。HGC27细胞在SPION-Ex(40ug/ml)存在或不存在的情况下培养24小时。采用CCK-8法检测HGC27细胞对SPION-Ex处理的反应。如所示，SPION-Ex/MF对HGC27细胞的细胞毒性比未修饰的N-Ex和SPION-Ex具有更高的细胞毒性。同样，SPION-Ex/MF在其他肿瘤细胞中也表现出更强的细胞增殖抑制作用。然而，即使使用外部MF，SPION-Ex/MF对正常细胞也没有毒性。细胞集落形成实验结果显示，与对照细胞相比，SPION-Ex/MF（40ug/ml）处理的肿瘤细胞形成的集落明显更小、更少，其效果比5-氟尿嘧啶（5-FU）（30ug/ml）更显著。流式细胞术结果显示，SPION-Ex/MF（40ug/ml）比5-FU（30ug/ml）、N-Ex（40ug/ml）和SPION-Ex（40ug/ml）诱导的细胞凋亡比例增加。染色结果也证实，与无磁场的5-FU、N-Ex和SPION-Ex相比，SPION-Ex/MF最显著地降低了肿瘤细胞的线粒体膜电位。在SPION-Ex/MF组中，细胞色素c和caspase-3的表达也增加，表明当应用外部MF时，SPION-Ex更有效地促进细胞凋亡。总之，这些数据表明，SPION-Ex/MF在体外发挥了较好的抗肿瘤作用。图4.SPION-Ex体外治疗效果得到明显提高
接下来，研究人员使用由BALB/c裸鼠中HGC27细胞建立的皮下移植肿瘤模型来研究SPION-Ex的肿瘤靶向能力和治疗反应。当肿瘤大小达到50mm3时，将小鼠分为三组(PBS、SPION无MFSPION-Ex、SPION-Ex/MF；每组n=4)。将dir标记的SPION-Ex静脉注射到小鼠体内（5mg/kg），通过体内成像系统（IVIS)在注射后的不同时间（12、24、48和72小时）观察SPION-Ex在外部MF下的生物分布。结果所示，在MF下的肿瘤中检测到dir标记的SPION-Ex较强的荧光信号，注射72小时后荧光信号主要定位于肿瘤部位。在体内成像后，切除主要器官和肿瘤组织进行体外成像。与体内成像结果一致，结果表明，SPION-Ex/MF具有显著的肿瘤靶向能力。
研究人员进一步检测了SPION-Ex/MF在另一组荷瘤小鼠中的抗肿瘤疗效。将小鼠分为6组，在肿瘤接种后12、16、20、24、28、32、36天给予不同治疗（PBS、SPION、5mg/kg体重、5kg体重、N-Ex、SPION-Ex、SPION-Ex/MF、5mg/kg）。肿瘤大小结果显示，在外部MF下使用SPION-Ex治疗可有效抑制体内肿瘤生长。不同组小鼠的存活率如图所示。无MF组的PBS、SPION、5-FU、N-Ex和SPION-Ex组小鼠的平均生存时间分别为45、47、67、61和59天。用SPION-Ex/MF处理的小鼠存活了86天，40%的小鼠存活到研究结束。老鼠的体重SPION-Ex/MF组与PBS组相当，而5-FU组小鼠在治疗后体重显著下降。
研究人员为了进一步评估SPION-Ex/MF的安全性，在最后一次注射后3天，收集小鼠的主要器官。Ki-67和TUNEL染色结果显示，与SPION-Ex无MF组相比，SPION-Ex/MF组的Ki-67阳性细胞更少，而TUNEL阳性的凋亡细胞更多。此外，SPION-Ex/MF组肝脏冷冻切片中的荧光信号均低于无MF组的N-Ex和SPION-Ex组。这些结果表明，SPION-Ex/MF比未修饰的N-Exan具有更强的靶向治疗效果。图5.SPION-Ex的体内肿瘤靶向能力及治疗效果
研究人员为了测试NNV作为药物传递载体的可能性。他们生产了含dox的阳离子脂质体(DOX-cl)，然后将DOX-cl与中性粒细胞孵育，产生携带DOX的中性粒细胞，并通过连续挤压法产生NNV-DOX。与单独使用DOX和NNV的组相比，SPION-NNV-DOX/MF组的HGC27细胞线粒体膜电位明显降低。然后，他们评估了SPION-NNV-DOX/MF对BALB/c裸鼠中由HGC27细胞建立的小鼠异种移植瘤模型的抗肿瘤作用。一旦肿瘤生长到约50mm3，小鼠静脉注射PBS、DOX-CL（5mg/kg体重）、NNV（5mg/kg体重）和SPION-NNV-DOX（5mg/kg体重、DOX；含或不含MF），持续7个周期（4天/周期）。与不含MF的DOX、NNV和SPION-NNV-DOX相比，SPION-NNV-DOX/MF表现出最强的肿瘤生长抑制作用。肺毒素-DOX/MF显著延长了小鼠的中位生存时间，从65（DOX-CL）、58(NNV)和82（SPION-NNV-DOX）延长至140天（SPION-NNV-DOX/MF）。此外，SPION-NNV-DOX/MF组小鼠的体重无明显变化，说明该治疗的安全性。并且SPION-NNV-DOX/MF组的荧光信号主要聚集在肿瘤部位，最后一次注射后3天在肝脏中观察到边缘荧光信号。Ki-67和TUNEL染色结果显示，与其他组相比，SPION-NNV-DOX/MF对肿瘤组织增殖的诱导凋亡程度最高。图6.SPION修饰的n-ex样NVs传递DOX抑制肿瘤生长
为了进一步证明SPION-NNV是一个很有前景的传递DOX和治疗癌症的平台，研究人员在严重免疫缺陷的NCG小鼠中构建了另一个皮下异种移植瘤模型，将SW480细胞皮下植入NCG小鼠(每组n=7)，并按上所述进行处理。体内生物分布数据显示，SPION-NNV-DOX/MF的荧光信号主要聚集在肿瘤中；重量结果显示，SPION-NNV-DOX/MF抑制肿瘤生长的效率高于DOX-CL、SPION-Ex、SPION-Ex/MF、SPION-NNV、SPION-NNV/MF和SPION-NNV-DOX；与其他组相比，SPION-NNV-DOX/MF处理后，ki-67阳性细胞数量明显减少，TUNEL阳性细胞数量明显增加。DOX-CL治疗导致小鼠体重下降，并导致主要器官的毒性，而SPION-NNV-DOX/MF治疗的副作用最小。总之，NNV被用作一种新型的纳米颗粒平台，可以提供DOX的更高的肿瘤靶向性和提高治疗反应。图7.SPION-NNV-DOX治疗荷瘤NCG小鼠的疗效观察
本文的研究团队从健康供体的外周血中性粒细胞中分离出外泌体，并表明这种中性粒细胞来源的外泌体（N-Ex）通过激活细胞凋亡信号通路对肿瘤细胞产生细胞毒性。并且开发了一种快速磁分离方法，从中性粒细胞中分离出外泌体，并赋予N-Ex双重肿瘤靶向能力（生物靶向和磁靶向），大大提高了其治疗效果。此外，研究团队还高产率制造了中性粒细胞来源的纳米囊泡（NNVs），作为化疗药物的新递送载体具有重要的意义。
教授介绍：
张徐
张徐，江苏大学医学院副院长，教授，博导。
江苏省“杰青”获得者，江苏省“六大人才高峰”高层次人才，江苏省“333工程”中青年科技带头人。江苏省检验学会青委会副主任委员，中国抗癌协会肿瘤分子医学专委会委员，国家卫健委胃肠肿瘤诊治重点实验室学术委员，担任多种SCI学术期刊编委和审稿专家。
主要研究方向：外泌体与肿瘤；肿瘤分子诊断；肿瘤微环境。
参考文献：
Jiahui Zhanget et al. Engineered neutrophil-derived exosome-like vesiclesfor targeted cancer therapy [J].Science Advances.2022 Jan 13.