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综述文章，只翻译，不评论，为了开拓眼界。
摘要：卵巢癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一。经初步诊断，大多数患者表现为腹腔内广泛的转移性生长。这种转移性生长是分阶段发生的，转移前生态位的形成发生在宏观肿瘤细胞侵袭之前。原发性卵巢肿瘤释放的外泌体是一种细胞外小泡，为加速转移侵袭准备了远处肿瘤微环境。它们调节肿瘤细胞与正常间质、肿瘤相关成纤维细胞和肿瘤微环境内局部免疫细胞之间的细胞间通讯。在这篇综述中，我们强调卵巢癌外泌体作为转移前生态位形成的协调物、适合液体活检的生物标记物和化疗靶点的新作用。
背景：卵巢癌是最致命的妇科恶性肿瘤，占所有女性癌症的2.5%，占女性癌症相关死亡的5%。在美国，2018年约有22240例新诊断卵巢癌病例，14070例死亡。卵巢癌患者的死亡率很高，因为通常在晚期（III或IV）被诊断为肠梗阻和全身受累[3]。在这些晚期III期或IV期病例中，卵巢癌的5年生存率低于29%，而早期I期患者的5年生存率为70%[4]。因此，迫切需要研究卵巢癌转移的机制及相关的生物标志物，以便早期诊断和治疗卵巢癌I期患者。
最近的研究表明，卵巢癌转移前的生态位是转移的普遍先决条件。转移前生态位是一种预先形成的微环境，由肿瘤原发部位在广泛转移前分泌的外泌体所形成。这些外泌体优化了卵巢癌定植、生长和转移的环境。这种环境是通过免疫抑制和逃避、血管生成、癌相关成纤维细胞（CAF）和重塑局部间质的肿瘤巨噬细胞介导的。各种研究表明，外泌体在肿瘤的发生、生长、凋亡、免疫反应和肿瘤的化疗抵抗中起着关键作用（图1a）。然而，直到最近，它们在转移前生态位建立中的作用才得到重视。尽管直径为30-100nm，这些盘状膜囊泡含有蛋白质、脂质、DNA和RNA的独特特征，使其成为强大的致瘤因子和诊断生物标记物。在卵巢癌的腹水和血液中都可以检测到外泌体，使他们易于接受微创诊断和早期靶向治疗的潜在目标。本文就外泌体在卵巢癌转移中与转移前生态位形成的关系进行综述。
外泌体发生。
外泌体的性质和丰度取决于其来源的供体细胞-无论是健康组织还是肿瘤。外泌体生物发生涉及一系列细胞事件，最终导致致癌或生理亚型。供体细胞首先内化细胞外配体和产物，形成早期内体。新生的外泌体在内腔小泡（ILVs）的管腔内形成，最终通过蛋白质、核酸和脂类的选择性包合而成熟为多泡内涵体（mve）。有些MVE在溶酶体内融合和降解，为细胞形成提供必要的能量和物质，而另一些MVE则通过高尔基体再循环或直接细胞分泌释放到细胞外环境中。运输所需的内涵体分选复合体（ESCRT）是膜成形和断裂的主要驱动力，也是MVE和ILV形成的第一个公认机制。最终的外泌体物质驱动其最终功能，并通过一系列高度选择性的调控阶段来实现。它包括内蛋白分类和通过ESCT-0、−I、−II和-III以及VPS4、VTA1、ALIX/PDCD6IP和TSG101将泛素化蛋白质精确ESCT裂解为ILV。脂质如神经酰胺、胆固醇和四个跨膜蛋白超家族（包括CD9、CD63和CD81）也介导外泌体蛋白的分类。在核酸水平上，外体mRNAs根据其3′UTR的Z-拉链结构以及RNA诱导的沉默复合物（RISCs）被分为mve。ARF6-Exportin-5轴将miRNA前体运送到肿瘤微泡中。这些调控方法揭示了卵巢癌外泌体从周围健康组织中获得独特分子特征的机制。
卵巢癌外泌体
卵巢癌与其他人类肿瘤的不同之处在于它喜欢通过腹水侵入腹膜腔，这使得它特别擅长于累及腔室内的各种脏器。从早期开始，腹水包含分离的肿瘤细胞、各种免疫细胞、间皮细胞和肿瘤相关的外泌体。这些外泌体可以从卵巢癌患者的腹水和血清中分离出来。重要的是，这些外显体含有卵巢癌特有的蛋白质特征，包括膜蛋白（Alix，TSG101）、小GTPases（Rab蛋白）、膜联蛋白、四肽（CD9、CD82、CD63和CD81）、热休克蛋白（Hsp90、Hsc70）、抗原（MHCI和II）、Nanog和酶（磷酸异构酶、过氧化物酶、醛）还原酶，脂肪酸合成酶（图1b）。除了揭示一种潜在的恶性肿瘤外，外泌体蛋白载物还具有促进卵巢肿瘤转移的作用（表1）。
例如，Nanog是一种转录调节因子，参与肿瘤细胞增殖和肿瘤干细胞的自我更新。与良性腹膜液相比，从高级别浆液性卵巢癌腹水中取样的外显子体中Nanog的表达明显更高。Nanog基因敲除研究显示卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力下降。致瘤microRNAs（miRNA）也已在外泌体中被鉴定出来，在外泌体中它们被包裹并防止核酸酶降解。在功能上，这些外泌体内的miRNAs可局部和系统地调节靶细胞的基因表达。一旦脱落，卵巢癌源性外泌体水平地将其miRNAs转运至肿瘤相关巨噬细胞（TAM）、间皮细胞和肿瘤细胞本身。它们为恶性肿瘤早期转移前生态位的形成和转移提供了指导。
外泌体在转移前生态位内引起免疫抑制
免疫系统是转移的重要屏障。为了使卵巢癌在新的环境中茁壮成长，转移前的生态位保护转移细胞在进入转移部位时不发生凋亡是非常重要的。从卵巢癌腹水中分离出的外泌体可以诱导快速可逆的T细胞阻滞。最近的一项研究发现，GD3是一种神经节苷脂，在从腹水中分离出来的外体表面表达，通过作用于T细胞受体（TCR）来阻止T细胞。卵巢癌相关外泌体也可以通过激活toll样受体（TLR）诱导单核细胞产生IL-6。IL-6激活免疫细胞、间质细胞和肿瘤细胞中的信号转导和转录激活因子3（STAT3）通路，从而支持癌细胞的整体免疫逃逸。
为了揭示外显体对免疫细胞的直接作用，各种研究将卵巢癌患者腹水中的外泌体与树突状细胞、造血干细胞和外周血淋巴细胞共培养。其中一项研究显示，外泌体通过诱导造血干细胞、树突状细胞和外周血淋巴细胞凋亡来引起免疫抑制（图2a）。在另一项研究中，正常外周血淋巴细胞与卵巢癌腹水或良性卵巢囊肿患者腹腔冲洗液中的外泌体共培养，并对淋巴细胞进行基因表达分析。他们发现与良性卵巢囊肿组相比，恶性腹水共培养组有26个免疫抑制基因的过度表达。这些发现支持外泌体通过与白细胞的直接相互作用来抑制外周免疫，从而使肿瘤不受损害。包括CD4+和CD8+T细胞在内的适应性免疫反应，以及先天性免疫细胞在转移的地方被强烈招募。这些免疫细胞是对抗肿瘤进展的强有力的生理防御。越来越多的证据表明，来自卵巢癌细胞的外泌体可以使肿瘤微环境中的免疫细胞沉默，并在转移前的生态位形成中起关键作用。除了重新编程免疫细胞基因图谱，卵巢癌细胞还释放携带Fas配体（FasL）的外泌体促进T细胞凋亡。在细胞水平上，溶血磷脂酸提高卵巢癌细胞表面FasL的表达，从而促使FasCarrieng外泌体的释放。此外，卵巢癌外泌体携带磷脂酰丝氨酸，通过阻断细胞内信号级联抑制T细胞活化。NK细胞是一类重要的先天性免疫效应细胞，直接识别和杀伤肿瘤细胞。NKG2D受体配体是NK细胞重要的激活细胞毒性受体，也是卵巢癌外泌体下调的靶点。抑制NKG2D可以避免NK细胞的细胞毒性，允许肿瘤细胞免疫逃避和强大的转移前生态位。
外泌体促进转移前生态位的血管生成
为确保充足的血液供应，VEGFR1+造血祖细胞在转移前生态位内启动血管生成。此外，局部内皮祖细胞通过VEGF信号促进血管生成。除了血管生长外，促血管生成的微环境增加了多种细胞类型（包括VEGFR1+造血祖细胞、免疫细胞、基质细胞和肿瘤细胞归巢）的血管通透性。这种先前的血管生成使得转移前的生态位能够满足随后快速转移生长的营养需求。卵巢癌外泌体最近因促进血管生成而声名狼藉（图2b）。其中一项研究证明了它们能够增强人脐静脉内皮细胞的活性和迁移能力。在分子水平上，蛋白质组学揭示了位于卵巢癌外显体中的激活转录因子2（ATF2）和转移相关蛋白1（MTA1）上调血管生成。CD147是一种在癌细胞中表达的致瘤膜结合分子，它调节肿瘤周围基质细胞中基质金属蛋白酶的表达。卵巢肿瘤释放的CD147阳性外泌体也促进人脐静脉内皮细胞的血管生成。卵巢癌患者的腹水中以一种独特的非血管内皮生长因子（VEGF）为载体的可溶性E-cadherin（sE-cad）是一种强有力的血管生成激活剂。从机制上讲，sE-cad阳性外泌体与内皮细胞上的VE-cadherin结合，促使信号级联，最终激活βcatenin和NF-κB；这刺激内皮细胞迁移和总体血管通透性。尽管其体积小，但越来越多的研究支持卵巢癌源性外泌体在培养广泛腹膜转移的血管生成肿瘤生态位中的作用。
基质重塑中的外泌体
从原发肿瘤转移到继发部位的癌细胞的存活取决于间质微环境。肿瘤源性外泌体通过培养和重塑转移部位的间质细胞来协助这一过程，以支持肿瘤细胞的生存和转移扩散。在功能上，他们重新编程的基质细胞在转移前的生态位，包括癌相关成纤维细胞（CAFs）和周细胞。在转移性微环境中，外泌体也与肿瘤相关巨噬细胞（TAM）相互作用，负责肿瘤生长、侵袭、血管生成和整体转移。
外泌体将成纤维细胞转化为CAFs
CAFs是一种独特的、重编程的间质细胞，在肿瘤发生、细胞外基质重塑、进展、转移前生态位形成和转移中发挥作用。它们在局部基质细胞微环境中分泌TGF-β、基质细胞衍生因子-1α（SDF-1α）、S100A4、纤维连接蛋白和基质金属蛋白酶的致瘤细胞因子环境。虽然这些信号分子在形成肿瘤微环境方面具有独特和特殊的过程，但它们都有助于转移前生态位内的基质重塑。在一项研究中，比较了正常成纤维细胞和卵巢癌旁成纤维细胞的miRNA谱，发现卵巢肿瘤旁成纤维细胞一致地显示miR-31和miR-214下调，miR-155上调。这些研究人员通过将miR-31和miR-214模拟物或miR-155抑制剂转染到正常成纤维细胞中，使其转化为CAFs，从而证明了miRNA信号的重要性。这表明卵巢癌来源的外泌体本身就足以诱导正常间质成纤维细胞表型和功能的改变，形成致病性CAFs（图2c）。类似的研究也支持了外泌体在正常间质向CAFs过渡中的作用。卵巢癌能够通过过度表达α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、SDF-1和TGF-β，将脂肪源性间充质干细胞转化为CAFs。因此，正常间质向癌间质的重编程可以通过细胞因子信号在继发性转移生长之前介导。
外泌体诱导巨噬细胞极化。
巨噬细胞是多功能抗原提呈细胞，典型地分为两种极化表型：促炎性（M1）和抗炎（M2）。肿瘤相关巨噬细胞（TAM）属于M2亚型，可渗透到恶性组织中。在肿瘤微环境中，TAMs分泌IL4、IL-5和IL-6，促进血管生成、基质重塑和免疫系统抑制。它们还通过STAT3信号级联分泌TGF-β、SDF-1和VEGF来促进转移前的生态位。在卵巢癌中，缺氧诱导因子（HIF）诱导释放富含各种miRNAs的外显体，包括miR-21–3p、miR-125b-5p和miR-181d-5p。当这些外泌体被未分化的巨噬细胞吞噬时，它们通过细胞因子信号（SOCS）4/5/STAT3途径的抑制因子进行M2极化（图2d）。最近的一项研究表明，卵巢癌细胞与巨噬细胞共培养后，只能通过外显体将癌基因miR-1246转移到M2巨噬细胞而不是M1巨噬细胞。作为后续研究，miR-1246抑制剂和化疗方案的联合应用显著降低了体内肿瘤负担。这些新兴的研究支持了M2亚型在肿瘤发生和转移前生态位形成的多个阶段的作用。
转移前生态位中的外泌体培养细胞促进转移
卵巢癌外泌体直接促进肿瘤细胞在转移前的生态位内归巢、定植和生长，同时抑制宿主的抗肿瘤免疫反应。它们还通过促进宿主细胞向TAM和CAF表型转化来促进肿瘤细胞增殖和侵袭（表3）。实验证据表明，体外培养的tam能够在体外和体内小鼠模型中促进卵巢癌的增殖和迁移。这是由于TAMs的细胞因子谱的结果，它们分泌大量的EGF，从而激活外周卵巢癌细胞中的EGFR。这种EGF/EGFR信号级联上调血管内皮生长因子C（VEGF-C），进而上调整合素和细胞间粘附分子（ICAM-1）。这会诱导卵巢癌细胞的增殖、迁移、粘附、球体形成和腹膜植入（图3b）。在转移前的生态位中，肿瘤来源的外泌体将局部成纤维细胞转化为CAFs，CAFs通过自身的外泌体分泌支持肿瘤的发生。当卵巢癌细胞摄取富含TGFβ1的CAF外泌体时，它们上调TGFβ1的表达，并通过SMAD信号级联更善于迁移和侵袭。除此之外，CAFs还能增强基底膜的通透性，使肿瘤细胞更好地侵入未侵犯的局部间质。化疗和外泌体功能之间存在着独特的相互作用。有趣的是，最近有研究表明，乳腺癌外泌体在化疗后增强了肺转移前的生态位形成能力。（化疗会促进肿瘤转移看来不止我这么认为哈）在另一项研究中，研究人员展示了一线化疗药物顺铂通过激活NFκB信号通路增加卵巢癌患者产生IL6的肌纤维母细胞CAFs。此外，他们还证明，用众所周知的糖尿病药物二甲双胍预处理可以抑制基质NFκB/IL6的激活，并降低卵巢癌细胞的化疗耐药反应。转移性和耐药的复发性卵巢癌与匹配的原发性肿瘤相比产生明显高的IL-6。卵巢癌患者腹水中IL-6水平升高与预后不良相关。
在转移前的生态位中，外泌体突破了肿瘤侵袭的屏障
大约70%的卵巢癌患者在手术时有腹膜转移。典型的肿瘤细胞巢涉及腹膜、大网膜、肠系膜、膈肌和腹盆内脏表面（图3a）。这些转移灶是由腹水内的肿瘤引起的；然而，血源性转移到大网膜的病例也会发生。组织学上，大网膜和腹膜都是松散的胶原网络，有血管化的结缔组织、分散的成纤维细胞、脂肪细胞和巨噬细胞。它们被一层富含微绒毛的间皮细胞和一层薄薄的基底膜所覆盖（图3b），循环中的卵巢癌细胞必须破坏这层细胞。转移的方式决定了侵袭的障碍。在血行途径中，肿瘤细胞穿透内皮细胞表面，在腹水途径中，肿瘤细胞浸润间皮。
卵巢癌外泌体通过诱导血管内皮细胞迁移促进血管生成，促进肿瘤细胞归巢到转移前的生态位。腹膜脏器转移性生长明显缺乏间皮，表明这些细胞在肿瘤发生过程中被清除，可能发生在大规模转移性侵袭之前。从机制上讲，卵巢癌细胞释放带有特异性miRNAs的外泌体（例如miR-21和miR-29a）进入腹水，从而重塑间皮细胞层以增强腹膜穿透力（图2e）。卵巢癌患者血清miR-99a-5p显著升高，促进细胞侵袭。CD44在卵巢癌大网膜转移患者腹膜间皮细胞中高表达。这是通过外泌体条件途径发生的，卵巢癌外泌体将CD44转移到腹膜间皮，从而清除其物理屏障。MMP1表达与卵巢癌预后有关。这些蛋白酶的mRNA水平地从卵巢癌胞外体转移到腹膜间皮，通过自我破坏引起腹膜间皮细胞凋亡。
外泌体作为转移前生态位生物标志物及其治疗应用
早期发现转移前的生态位仍然是妇科肿瘤学领域的一个重要目标，尤其是考虑到与晚期诊断相关的严重不良结果。因此，新技术已寻求检测高渗透性、缺氧和炎症区域，以及具有转移生态位特征的细胞外基质改变区域。然而，许多这些技术的准确性较低，尚不适合临床应用。外泌体作为转移前生态位形成的生物标志物具有许多独特的优势，因为它们非常稳定、丰富且具有肿瘤特异性。因此，它们是血液或腹水中有希望的生物标志物，值得对这种致命癌症进行认真的研究，尤其是考虑到它们在其他癌症中的成功。例如，携带迁移抑制因子（MIF）的胰腺肿瘤的外显体被肝脏内的Kupffer细胞选择性摄取，因此在肝转移前生态位形成中起着重要的启动因子。同样，黑色素瘤特异性蛋白酪氨酸酶相关蛋白2（TYRP2）的外体水平作为黑素瘤转移的预测因子已经引起了人们的兴趣。
液体活检是一种可以从体液（如血液或腹水）中分析循环肿瘤细胞、无细胞核酸和肿瘤来源的外泌体的技术。2016年1月21日，首个基于外泌体的癌症诊断产品在美国上市。这项技术特别适用于卵巢癌的诊断，因为外泌体可以以相对非侵入性的方式从腹水中检测出来。液体活检中最先进的生物传感器通过高度特异性的靶点选择、生物抗原传感和信号转导技术检测癌变的外泌体。至于靶点选择，miR-200b和miR-200c的水平与卵巢癌的不良预后相关，并且与卵巢肿瘤标记物CA-125显著相关。肿瘤相关抗原在外泌体表面显著，可用于高灵敏度的癌细胞检测。例如在胶质瘤（GBMs）中富含VEGF-A、信号蛋白3A和TGF-β的外泌体，鼻咽癌中的HIF1-α，纤维肉瘤和黑色素瘤中的MT1-MMP。这些与外泌体相关的蛋白质对于其来源的癌症来说是独一无二的，因此特别是对于未知癌症亚型的患者来说，是液体活检检测的理想靶点。为了达到这个效果，各种恶性肿瘤已经被研究，包括黑色素瘤、鼻咽癌、乳腺癌、结直肠癌和卵巢癌。最近，一种基于微流控芯片的液体活检技术能够分离出卵巢癌中含有详细蛋白质和信号通路的外泌体。
基于外泌体的治疗策略也正在出现，并通过利用外泌体对原发癌细胞的归巢效应发挥作用。通过将卵巢癌外泌体植入工程化生物材料中并植入小鼠模型的腹腔内，产生转移前的小生境模拟物。这种人工的转移前生态位有效地从腹水中吸收并捕获游离卵巢癌细胞，从而阻止这些细胞向正常盆腔脏器归巢。存活率显著提高。另一项新兴技术利用细胞靶向适体修饰的胞外囊泡，其外泌体嵌入黑磷中。当适配子将生物诱导的细胞外小泡导向靶细胞时，黑磷衍生的无机磷酸盐促进了细胞的生物矿化。这种靶向技术有可能消除转移前的生态位，是未来化疗研究的一个新领域。
当准备转移前的生态位时，肿瘤来源的外泌体经历到首选的器官和细胞特异性的位置。外体蛋白质组学揭示了整合素的表达模式在这一过程中起主要作用。外泌体整合素α6β4和α6β1促进肺转移，αvβ5与肝转移有关。治疗上，靶向整合素α6β4a和dαvβ5分别减少外显体摄取和肺、肝转移。这些外体整合素是液体活检中转移前生态位形成的另一个预测因子，对高转移率的癌症尤其有价值。总的来说，由于不同的癌症在其各自的转移前小生境中表现出不同的机制和外泌体特征，因此肿瘤特异性生物标记物和治疗策略很可能具有可接受的特异性。此外，考虑到卵巢癌外泌体中存在的转移前生物标记物及其在转移前生态位形成中的作用，近年来液体活检诊断技术的进展使外显体成为早期筛查和检测的一个有希望的新领域。