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本文作者研究了APOC1对巨噬细胞极化的影响，并做了巨噬细胞对肿瘤细胞的促进作用。其实这些在常规实验性文章中都是常规操作，本文甚至没有体内实验验证，想上十分很难。而当生信与实验结果完美契合时，自然会起到加分作用。
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研究概述：
载脂蛋白C1(APOC1)已被发现在多种癌症的增殖和转移中起着重要作用，但其相关机制尚未阐明，特别是其在肿瘤免疫中的功能和作用。本文经过系统的泛癌分析、与免疫相关基因共表达情况、单细胞测序数据分析探究APOC1肿瘤免疫中的功能及作用并探究了APOC1在不同癌症中的预后情况，最后，本文在肾细胞癌(RCC)患者的组织及血清中进行了相关实验的验证。
研究结果：
一、APOC1在癌症中的表达及与肿瘤免疫浸润水平评估
1、基于TCGA和GTEx数据分析了33种癌症与正常样本之间APOC1的表达水平发现，各种癌症类型中APOC1表达均上调，并且在肝脏中表达水平最高。（图1A)
2、使用wilcox试验评估APOC1与免疫检查点表达之间的相关性。除LIHC外，APOC1与PD-L1、CTLA4、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L2、siglec-15和TIGIT的转录本呈显著正相关,提示它可作为抑制肿瘤免疫应答的标志物（图1B）
3、使用CIBERSORT, QUANTISEQ 和TIMER数据库评估APOC1与免疫细胞浸润水平的相关性发现，APOC1在癌症中的表达水平与多种免疫细胞的浸润密切相关。APOC1表达水平较高的肿瘤组织伴随着M2巨噬细胞、M1巨噬细胞、M0巨噬细胞等，而APOC1表达水平相对较低的肿瘤组织则伴有较高的幼稚CD4+T细胞、静息记忆CD4+T细胞、静息NK细胞等细胞（图1C-E）
二、APOC1主要在巨噬细胞或与肿瘤相关的巨噬细胞中表达
对不同代表性组织的细胞测序进行分析发现，在正常组织中，以肺为例，APOC1几乎只在巨噬细胞中表达。在恶性GBM中，绝大多数的APOC1在小胶质细胞/巨噬细胞和与肿瘤相关的巨噬细胞中表达。跨组织免疫细胞分析的单细胞测序也发现APOC1主要在巨噬细胞中表达。综上，APOC1主要在巨噬细胞中表达，其作用是通过影响巨噬细胞的功能在肿瘤免疫中实现的。（图2A-F）
三、APOC1与多种癌症的预后显著相关
1、Cox风险模型分析显示，APOC1的表达水平与肾上腺皮质癌(ACC)、食管癌(ESCA)、肾肾透明细胞癌(KIRC)、LIHC和子宫癌肉瘤(UCS)的OS显著相关。K-M曲线提示，APOC1水平较高的KIRC、ACC、STAD患者的总生存时间较短，THCA、LIHC、SKCM患者APOC1高表达与良好的OS相关。（图3A-G）
2、APOC1的表达水平与ACC、ESCA、KIRC、肾肾乳头状细胞癌(KIRP)、脑低级别胶质瘤(LGG)和LIHC患者的DSS显著相关；K-M曲线显示高水平APOC1 KIRC、LGG、ESCA患者无病生存时间较短，而宫颈腺癌(CESC)、甲状腺癌(THCA)、LIHC患者中，APOC1高表达与良好的DSS相关。(图3H-N)
以上提示，APOC1在不同类型的癌症中具有一定的预后价值，有望发展为一种预后生物标志物。
四、APOC1在肾细胞癌患者的肿瘤和血清中显著上调，并与免疫浸润水平密切相关
1、检测人体组织样本中APOC1的mRNA和蛋白表达水平。结果还显示，RCC中APOC1的mRNA和蛋白表达水平显著高于邻近组织。（图4A-B）
2、IHC分析显示，APOC1的表达与年龄、临床分期、Furhman等级显著相关（图4C-D），但与性别、肿瘤大小无关（表2）
3、ELISA检测结果提示，RCC患者血清APOC1水平明显高于正常对照组。（图4E）
4、在肾细胞癌的免疫浸润细胞中，APOC1与巨噬细胞浸润的关系最为密切APOC1的拷贝数变化与KIRC和KIRP肿瘤微环境中各种免疫细胞的浸润水平相关（图4F-H）
5、在KIRC中，APOC1表达与B细胞、CD8+T细胞，中性粒细胞等浸润水平正相关，但与CD4+T细胞负相关。但在KIRP中APOC1表达与上述免疫细胞浸润水平呈正相关，且相关性较高。（图4I-J）
五、APOC1对于M2表型TAMs的生成至关重要
1、采用TAMs的体外模型进行验证发现，TAMs表现出较高水平的M2标记物CD163和CD206。qPCR结果显示，TAMs表达的M2标记物CD163、CD206、ARG1和IL10的水平更高。(图5A-D)
2、qPCR、Western blot实验证实APOC1在M2和TAMs中的表达水平显著升高。流式细胞术分析发现，通过沉默APOC1的表达，可以逆转与786O和769 P细胞共培养的的TAMs的M2极化。(图5E-H)
3、沉默APOC1的表达，在与786 O细胞(或769 P细胞共培养的TAMs中，M2标记物的相对表达也受到抑制。(图5I-J)
以上结果提示：APOC1对RCC中M2表型TAMs的生成至关重要。
六、APOC1通过与CD163和CD206相互作用，促进巨噬细胞的M2极化
1、过表达APOC1后，巨噬细胞的形态明显改变；在过表达APOC1的巨噬细胞中，CD163和CD206的表达显著上调；过表达APOC1的巨噬细胞中，M2标记物(CD163、CD206、ARG1、IL-10)的相对表达也显著上调。(图6A-E)
2、APOC1与CD163和CD206共定位巨噬细胞，过表达APOC1显著上调CD163和CD206的表达水平，同时相互作用程度也增加。(图6F-I)
3、Co-IP实验验证了APOC1与M2巨噬细胞标志物CD163或CD206相互作用。（图6J）。综上，APOC1通过与CD163和CD206相互作用，促进巨噬细胞的M2极化。
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七、过表达APOC1的巨噬细胞通过分泌CCL5促进RCC细胞的转移
1、过表达APOC1的巨噬细胞条件培养基(CM)可以促进769P和786O细胞的迁移。过表达APOC1的巨噬细胞CM加速了769 P和786 O细胞的侵袭(图7A-C)。
2、过表达APOC1的巨噬细胞经CM处理后，转录因子Slug和Twist的表达显著上调，EMT关键蛋白E-cadherin、N-cadherin表达也发生变化，提示促进了EMT过程。（图7D-E）
3、Spearman相关检验发现，KIRC、KIRP中APOC1与CCL5的表达存在显著的相关性。并且实验表明过表达APOC1后，巨噬细胞中CCL5的mRNA和蛋白表达水平显著升高。（图8A-C）
4、CCL5中和抗体阻断了过表达APOC1的巨噬细胞对769P和786 O细胞的促迁移、促侵袭作用。(图8D-G)
综上，过表达APOC1的巨噬细胞通过分泌CCL5促进了RCC细胞的转移。
研究总结：
本研究表明，APOC1是一种与多种免疫细胞浸润相关的免疫学生物标志物。APOC1主要在巨噬细胞中表达，通过与CD163和CD206相互作用，调节巨噬细胞的极化和TAM的形成。此外，APOC1可以通过促进巨噬细胞中CCL5的分泌来促进肿瘤细胞的转移。总之，它有望成为癌症免疫治疗的一个潜在靶点。