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你不得不知道的GEO数据库芯片数据分析方法

大家好,我是阿琛。今天来给大家介绍一个新的专题内容---GEO数据库的使用方法。烹饪需要食材,分析需要数据。数据出发,整个研究的第一步就是数据的下载。对于大部分的研究者而言,拿公开的高通量数据,进行二次分析,是最佳的选择途径。

作为与TCGA数据库齐名的一个大型数据库,GEO数据库包罗万象,对于每个领域的科研工作者很有帮助。GEO数据库是一个储存芯片、二代测序以及其他高通量测序数据的一个数据库。利用这个数据库,我们可以检索到其他一些人上传的一些实验测序数据。

下面,我们来看一下如何使用GEO数据库中的芯片数据进行后续分析。

GEO数据库的简介

GEO数据库,GENE EXPRESSION OMNIBUS,是由美国国立生物技术信息中心NCBI创建并维护的基因表达数据库(官网:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。

它最初创建于2000年,主要用于收录各国研究机构提交的高通量基因表达数据,也就是说只要是在目前已经发表的绝大部分论文中,其涉及到的基因表达检测的数据,包括芯片数据,二代测序结果,以及其他形式的高通量检测结果,都可以通过这个数据库中找到。

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首先,我们进入GEO数据库中,根据GSE编号,查看一下该数据的一些相关信息。在搜索栏中输入编号,“GSE39582”,然后点击“Search”按钮,进行检索。

当然,熟悉了以后,我们也可以直接输入网址进行快速检索,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE39582;对于检索页面网址而言,其前面是一样的,唯一的区别是acc=后面的GSE编号,修改编号,可以快速进入对应的结果页面,这样也可以在一定程度上减少由于网速等原因所带来的阻碍。

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在结果页面中,我们可以初步看一下该结果对应的发布时间,题目,物种等信息。同时,Experiment type中Expression profiling by array表示该结果是通过芯片获得的表达谱;Overall design中简单介绍了整个研究的设计方案和分组信息。

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GEO数据的下载

当获得了芯片的GSE编号后,我们接下来需要将其对应的数据进行下载,从而根据自己的需要进一步分析。关于数据的下载,我们这里主要介绍三种不同的方法。

方法一:下载芯片的原始数据

在检索页面中,一路下拉;在Supplementary file中点击Download中的custom,展开原始数据对应列表;点击“Select all“,然后点击Download,即可将所有样本的原始数据RAW Data文件下载;

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虽然这是最直接的方法,但是RAW Data文件相对较大,对下载的网速要求相对较高,而且不同的芯片来源,有不同的处理方法,甚至有些芯片没有处理方法,因为其是对应定制的。所以,一般情况下,不推荐大家下载原始数据。

方法二:下载表达矩阵(series matrix)

在Download family中点击Serier Matrix File(s),进入下载页面;

待下载完成后,可以直接使用read.table()函数读取进来。

可以看到,在芯片中,包含了54675个基因探针,586个患者。

方法三:使用R的GEOquery包里面的getGEO()函数直接读取进来(推荐)

当然,考虑到网速问题,我们可以对参数进行设置,选择不下载平台的注释文件,因为一般来讲注释文件是相对比较大的。

如果把之前下载的series Matrix文件放在当前目录下,getGEO()函数会直接检测到该文件,并进而直接将其进行读取;

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我们可以直接查看一下下载结果gset的变量类型。

可以看到,变量gset是一个列表的形式。

为什么是list格式呢?因为一个GEO芯片项目,是可以对应多个芯片平台的,那么每个平台的数据结果会对应list里面的一个元素。

既然是列表,自然可以提取其中的第一个元素出来查看一下。可以看到,其中展示了包含了6个样本,33297个特征,以及相关的临床信息,PMID号,以及注释平台信息。

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提取表达和临床信息

3.1 通过pData函数获取分组信息

通过pData()函数,即可提取表达数据中的临床信息;同时,点击Environment中的pdata查看,我们可以查看里面的相关信息。可以看到,其中,非肿瘤的样品19例。

因此,根据临床信息,我们可以对样品进行分组,分为肿瘤组和正常组;

最终,得到正常组19例样品,肿瘤组566例样品。

3.2 通过exprs()函数获取表达矩阵并校正

整理完临床信息后,我们需要提取对应的表达数据。对于表达数据,除了下载Series Matrix后直接使用read.table()函数进行读取外,我们也可以直接从GEOquery下载得到的变量gset中进行提取。

使用exprs()函数可以从gset[[1]]提取表达信息;同时,我们可以使用boxplot()函数先简单看一下整体样本的表达情况。

由于每一次技术重复的时候,都会有误差,芯片的原始数据是由仪器读取的,不同的读取时间,或者扫描仪光线的强弱都会导致同一类型的样本出现误差。正式分析前,我们需要对其进行人工校正一下。这里我们用limma包内置的一个函数,

normalizeBetweenArrays()函数。

可以看到,经过校正,整个表达水平基本趋于一致。

此外,使用range()函数查看一下表达数据exp的取值范围;一般而言,范围在20以内的表达值基本已经经过了log对数转换。

ID变换

整理好了表达矩阵以后,我们需要将探针的id转换成为基因的Gene symbol。对于探针id的转换过程,目前主要是通过R包来进行转换。接下来,我们来看一下如何进行芯片探针id的转换过程。

方法一:使用R包转换

随着芯片平台的普遍使用,其基因的注释信息也被整理成了不同的R包;因此,通常情况下我们使用R包来注释。不同的平台,对应着不同的R包。首先,我们来看一下这个数据集使用的平台类型。

通过提取列表gset[[1]]中的注释信息,可以看到,该芯片使用的是我们最常见的平台,GPL570。

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对于GPL570,其对应的R包是hgu133plus2.db包;查找显示,其储存在Bioconductor中,下载并进行安装R包。

首先,我们来看看,在hgu133plus2.db包中,包含了哪些信息;

可以看到,除了Symbol信息外,在其中还包含了Ensemble id,Entrez id等信息,可以需要进行提取。

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提取其中的Symbol信息,可以看到,最终获得了probe id和Gene symbol的对应信息。

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其中,经过去重复,一共存在20174个不同的Gene symbol,且部分基因存在多条探针的对应关系。

接下来,我们需要将其进行一一对应匹配。

经过id匹配,并去重复,最终得到了20174个基因的表达结果;

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同时,我们可以查看一下前3行前3列的表达情况。

当然,除了R包注释外,还有其他的注释方法,比如使用网页下载的soft文件进行注释,或者有些特殊的芯片内容,需要自己手工比对注释。

方法二:使用soft文件注释

方法三:手工注释

PCA分析

表达矩阵到此基本整理完成。接下来,在正式的差异分析之前,我们首先可以做一个PCA分析,整体水平查看正常和肿瘤两组样品直接是否存在显著的差异。

结果显示:在该芯片中,癌和癌旁组织的表达水平存在一定的差异。

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差异分析

对于芯片数据的差异分析,我们一般使用limma包来进行。关于差异分析的输入文件,主要是两个,第一是整理好的表达矩阵,其中行名为基因名,列名为样本名;第二是分组信息(group list)

最终,使用topTable()函数提取所有基因的差异分析。

可以看到,在结果表格中,包含了6块的内容,包括我们常见的logFC值,以及P.Value,adj.P.Val等等。

接下来,我们需要根据设定的阈值,|logFC|>1.5和P值

可视化分析

1、火山图

对于差异分析结果,火山图和热图是两种最常见的展示方式。首先,我们来看一下火山图的绘制方法。对于火山图的绘制,大家可以参考之前的推文(生信最重要的图之一,十分钟帮你搞定!建议收藏!!)。

方法一:基于ggpubr包绘制火山图

结果显示:

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接下来,我们可以进一步给火山图添加标签,把显著上调和显著下调基因中前5名的基因名进行标注;

结果显示:

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方法二:基于ggplot2包绘制火山图

结果显示:

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当然,我们也可以对其进行添加标签的操作;

结果显示:

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2、热图

提取差异表达基因的表达情况;

结果显示:

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到此,GEO数据库芯片数据的下载,probe id的转换,差异分析已经基本完成了,整个文章中最难的80%内容也已经基本解决。接下来,就是针对这些差异基因的常规分析,包括GO分析,KEGG分析,GSEA分析,蛋白-蛋白互作网络(Protein-protein interaction,PPI)。

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