2022年2月，北京大学人民医院王俊院士团队在 Clinical and Translational Medicine 发表了题为“Single-cell RNA sequencing reveals the multi-cellular ecosystem indifferent radiological components of pulmonary part-solid nodules”的研究成果。通过比较肺腺癌早期患者部分实性结节的两个区域（磨玻璃样和实性部分）和正常肺组织，发现磨玻璃样成分的细胞景观更类似于实性部分。深入分析发现二者除免疫微环境存在轻微差别外，周细胞在两种不同放射学成分中也具有独特作用。该研究中单细胞转录组测序服务由博奥晶典提供。
【发表期刊】Clinical and Translational Medicine
【发布时间】2022年2月
【影响因子】11.492
【检测技术】10x Genomics 单细胞转录组测序
研究背景
随着胸部 CT 扫描的广泛应用，影像学上伴有亚实性结节（SSN）的早期肺腺癌（LUAD）的检出率显著提高。与实性结节相比，SSNs 具有惰性生长模式和良好的预后。根据薄层 CT 扫描特征可进一步将 SSNs 分为单纯磨玻璃（GG）结节和部分实性（PSNs）结节。前期研究表明 SSNs 的生态系统介于正常肺组织和实体肺腺癌之间，然而基于放射学区分的部分实性结节中的2个部分中，磨玻璃样成分的微环境与正常组织还是侵袭性成分更相似，微环境变化是否由磨玻璃成分向实性部分逐渐转化尚不知晓。
研究路线
研究结果
1、构建部分实性肺结节及正常肺组织单细胞图谱
为了解部分实性肺结节（PSNs）中磨玻璃样（GG）、实性部分与正常肺组织的区别，研究人员对来自12名未经治疗部分实性肺结节患者的磨玻璃样部分和实性部分组织样本以及5个非肺癌区域的正常对照组织，利用 10x 单细胞转录组测序技术进行检测，分析获得9种主要的细胞类型，包括 T 细胞、髓系细胞、自然杀伤（NK）细胞、B 细胞、血浆和黏膜相关淋巴组织 B 细胞（MALT B）、肥大细胞、成纤维和周细胞、内皮细胞和上皮细胞（肺泡细胞和癌细胞）。
通过比较三组间的免疫细胞发现，髓系细胞和 NK 细胞在对照样本中富集，并且其占比从健康样本向实性部分逐步减少。此外，从 GG 到实性部分 T 细胞、B 细胞、血浆和 MALT B 细胞的占比趋于增加，这些细胞在病变组织中的占比显著高于正常肺组织，暗示亚实性肺结节（SSNs）中适应性免疫应答的激活。通过免疫组化，研究人员也证实了 GG 和实性部分组织中免疫细胞类型的细微变化。
2、磨玻璃样及实性部分间肿瘤内异质性分析
接下来，研究人员对主要细胞类型表达谱特征进行分析。在上皮细胞中有种亚型，包括I型肺泡细胞（AT1）、II型肺泡细胞（AT2）、基底呼吸道上皮细胞和纤毛呼吸道上皮细胞，而其中能够诱发肺腺癌的 AT1 和 AT2 细胞最为丰富。为区分肿瘤组织中上皮细胞的恶性程度，研究人员分析了上皮细胞中的拷贝数变异（CNV）水平，发现同一个体来源的 GG 和实性样本具有相同的 CNV 模式，说明基因组特征与放射学影像特征不存在关联性，细胞降维分群结果则表明在不同患者来源的肿瘤在转录组水平具有明显的异质性。此外，GG 和实性样本在所有上皮细胞中具有相似比例的恶性细胞，表明不同的放射学影像表现并不是由细胞从正常转变为恶性的程度决定的。
为了解 GG 和实性组织中癌细胞的转录组特征及二者之间的差异，研究人员利用非负矩阵分解（NMF）的方法解析每个样本的肿瘤异质性。分析发现在 GG 和实性组织中存在7个相同的功能模块，涉及翻译起始、免疫激活、基于微管的运动、RNA 剪接、胞外基质重塑/上皮间质转化（EMT）、应激反应和体内平衡。而与 GG 中的肿瘤细胞相比，实性部分的肿瘤细胞中血管生成、EMT、KRAS 和 p53 信号传导及细胞周期相关通路显著上调。这些结果表明 SSNs 中两种放射学分型来源的恶性细胞具有不同的功能模式，可能导致二者增殖和侵袭性的差异。
3、亚实性肺结节实性部分 T/NK 细胞毒性作用受到抑制
对 T 细胞和 NK 细胞进行细分群，比较分析发现 GG 和实性部分 CD4+ T 细胞占比相当，但显著高于对照样本。效应 CD4+ T 细胞和效应记忆性 T 细胞是肿瘤样本中的重要细胞群，特征是高表达细胞因子 IL2，二者均表现出抗肿瘤功能。此外，耗竭的 CD4+ T 细胞高表达滤泡辅助性 T 细胞的 marker 基因 CXCL13 和 BTLA，并在肿瘤样本中富集。对 CD8+ T 细胞分析发现，虽然各亚群在3组样本中占比相近，但细胞毒性打分结果显示与 GG 组相比，实性组细胞的细胞毒性功能减弱。
相较于肿瘤样本，NK 细胞在正常肺组织中显著富集，并且高表达细胞毒性相关 marker，如 PRF1、NKG7 和 GNLY。细胞毒性打分显示，高表达 CD16 的 NK 细胞具有最强的细胞毒性，并且 CD16highGZMBhighNK 细胞从正常组织到 GG 和实性部分逐渐减少。基于上述结果，推测 NK 细胞的免疫应答在实性部分受到抑制，这可能会促进亚实性结节中其他侵袭性区域的免疫逃逸。
4、磨玻璃样和实性部分肿瘤中髓系细胞分析
巨噬细胞细分为4个亚群，其中 IL1Bhigh 肺泡驻留巨噬细胞表现出促炎的 M1 型巨噬细胞特征，相对高表达 IL1B、IL1A、肿瘤坏死因子（TNF）和 CXCL10-11，而另一亚群——血管周驻留巨噬细胞则表主要现出抗炎的 M2 型巨噬细胞特征。此外，血管周驻留巨噬细胞群还高表达血管生成相关基因，如 VEGFA 和 CXCL8，并且在肿瘤组织中更为富集。分析还发现，实性部分肿瘤中 M1 型巨噬细胞相关基因表达要低于 GG 肿瘤，暗示两种放射学分型的肿瘤中巨噬细胞具有不同的炎症程度。
DC 细胞分析得到3个亚群，分别为单核细胞衍生的 DC 细胞、迁移性 DC 细胞和2型 DC 细胞，三个亚群均在肿瘤样本中显著富集。对中性粒细胞的分析得到2个亚群，分别是 IL1Bhigh和 LI1Blow 亚型，他们在所有髓系细胞中显示出最强的急性炎症功能。中性粒细胞是人体先天免疫的第一道防线，可以通过释放大量具有生物活性的 IL-1β 以调节炎症消退。通过分析发现正常肺组织中中性粒细胞占比高于亚实性肺结节的任何一个组成部分，表明适应性免疫反应在肿瘤中被激活。
5、磨玻璃样和实性部分肿瘤中基质细胞功能分析
对内皮细胞重降维得到6个亚群，其中 INSR 是肿瘤相关内皮细胞的 marker 基因，其功能涉及血管生成，并且 INSR+ 肿瘤内皮细胞在肿瘤组织中更为富集，说明肿瘤微环境中内皮细胞亚型存在重塑。另一 ACKR1+ 肿瘤内皮细胞亚群在实性部分占位中显著富集。ACKR1 在肿瘤相关的血管内皮细胞中表达，这说明实性部分肿瘤中炎症反应上调。
通过对3组样本中的基质细胞进行受体-配体分析发现，基质细胞在肺癌的细胞间相互作用中起着至关重要的作用。实性肿瘤中，内皮细胞通过 CCL14-CCR1 信号招募 CD4+ T 细胞、CD8+ T 细胞和巨噬细胞，而在亚实性结节中观察到更为富集的内皮细胞与周细胞间 VEGF-VEGFR 信号传导。有趣的是，在实性部分肿瘤中发现了更多的从周细胞到内皮和肿瘤细胞的信号传导，推测周细胞在不同放射学肿瘤分型中有着独特的作用。
研究结论
本研究通过分析单细胞转录组测序数据，全面剖析了磨玻璃和部分实性结节的实性部分中细胞生态系统。分析发现在实性部分的恶性细胞中血管生成、上皮-间质转化、KRAS、p53 和细胞周期信号通路显著上调。对于肿瘤微环境，实性部分中髓系细胞和 NK 细胞的相对丰度往往高于磨玻璃区域，二者之间存在轻微的细胞亚型组成差异。另外，T/NK 细胞亚群的细胞毒功能和巨噬细胞的促炎功能在实性部分中受到抑制。
参考文献：
Li Yanmeng, Li Xiao, Chen Haiming et al. Single-cell RNA sequencing reveals the multi-cellular ecosystem in different radiological components of pulmonary part-solid nodules. Clin Transl Med, 2022, 12: e723.