点成分享| 低温冷冻保存技术的应用、定义和原理

引言：
低温生物学是研究在低温环境下对生物的生长、发育、遗传等和生命相关生理现象的一门新兴学科，它与我们的生活息息相关。

本文首先从低温冷冻保存技术在影视作品领域的应用出发，介绍其定义、原理，由此引申出低温冷冻保存的两种方法——慢速降温法和快速降温法，并对这两种方法的优劣势进行详细的阐述。

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Part1. 低温冷冻保存的应用
不知道大家看没看过或听过《三体》这个小说呢？
其中有个情节还蛮影响深刻的。三体第二部黑暗森林中出现了一种技术，低温休眠技术，即将目标速冻保存，等待数个世纪后高度发达的人类科技将目标唤醒。
然而利用低温休眠进行人类活动并不是《三体》的独创，在《越空狂龙》《星际穿越》《深空失忆》等一些经典的科幻作品中，都出现此类技术。

图1 低温冷冻保存技术的影视作品
虽然他们的叫法不同，但具体的操作描述大概都一样，是指在极短的时间内，将人冷冻在极低的环境下，使代谢停止，无限延长生命周期。
低温休眠技术代表着我们对未来无线的遐想，包括延长寿命、星际旅行，绝症治疗等。早在1972年就成立了Alcor基金会，该基金会在1976年进行了首例人体冷冻术，该机构为最早成立的人体冷冻组织机构。目前，已为100多人进行冷冻术。美国《财富》杂志称，Alcor的客户包括很多亿万富翁，他们向基金会捐赠大量资金，资助其研究人体冷冻技术。
但就现实层面而言，目前低温生物学的发展还难以达到想科幻电影中的那样完整个体的保存，更多的还是单体的细胞层面，比如胚胎、干细胞、哺乳动物细胞、精子、抗体、组织切片和啮齿动物器官等。
讲了这么久低温生物学的应用，那么低温生物学的确切定义究竟是什么呢？
低温生物学(cyrobiology)是研究低温对生物所产生的影响及低温在与生物有关的各个领域中应用的科学。它包括的内容十分广泛,几乎所有在低于正常(生物适于生存的)温度下进行的与生物有关的实验研究或理论探索都属于低温生物学的范畴。
它不仅保存我们刚刚科幻电影中提到的人体超低温冷冻保存，也包括冷链食品，疫苗等。
主要可以概括为以下4个方面:

• 采用低温科技治疗疾病或者生产药物
• 研究低温条件下保存(保鲜)用作食物的生物材料
• 研究利用低温条件保存活的生物材料(包括细胞、组织、器官,胚胎、甚至整个生物体)
• 以及研究低温条件下生物的生命过程所受到的影响及生物对这类影响的适应机制

Q：低温为什么可以进行生物样品的保存？
主要是因为：水份是生物样品里的主要成份，而在深低温，即温度低于-８0℃，水存在晶体状态和玻璃态２种物理方式。而从热力学角度分析，水的这２种状态的水分子都具有很高的粘度，并且几乎不会扩展。水的这个在深低温下几乎不会扩散的特性为生物样品的低温保存提供了可能。

Part2. 低温冷冻保存的方法
之前提到深低温状态下水存在的晶体状态和玻璃态２种状态，低温保存也同样分为慢速降温和快速降温（玻璃化）２种方式。
慢速降温保存通常采用“两步法”，即第一步先将生物样品采用某个较慢的降温速率降温到－８０°Ｃ并维持一段时间，然后第二步再将己经处于－８０°Ｃ状态的生物样品直接投入液氮罐里-１９６°Ｃ）进行深低温的长期保存。慢速降温法的实质是使用较慢的降温速率，使得降温过程中细胞内的水逐渐脱离细胞，以达到减少细胞内冰晶形成的概率的目的，从而提高细胞的存活率。他的优势是所用的冷冻保护剂浓度较低，只需要3%-20%左右，但容易造成冷损伤和渗透压失衡。
快速降温保存，即玻璃化方法就是用高浓度的冷冻稀释液,以极快的速率降温,使溶液内没有足够的时间形成冰晶核就直接转变成无形态的玻璃样固体的过程。此方法的优点是不用的程序控制降温仪,操作简便、快速,减轻损伤,但是由于在降温过程中需要加入大量的冷冻保护剂，高达40-60%v/v,这些冷冻保护剂往往存在一定毒性会杀死内部细胞，同时由于玻璃化过程中为了确保整个生物样品的内部和外部均能实现快速降温，需要减少样品的尺寸、以及增加和外界超低温环境（比如液氮）的接触面积。因此这种暂时只适用于小尺寸、小计量生物样品的保存，仅有ul单位。所以，目前大家还是通常采取慢速降温进行低温保存。
图2 低温冷冻保存方法汇总

刚刚提到的冷冻保护剂又是什么呢？它主要用于在低温保存生物样品过程中降低细胞的冷损伤。目前，常用的冷冻保护剂主要分为渗透性的低温保护剂和非渗透性的低温保护剂２大类。
渗透性的低温保护剂是指在低温保护剂添加到细胞悬浮液后，可以渗透到细胞膜内部的来置换出细胞的水分。渗透性低温保护剂主要有甘油、ＤＭＳＯ、丙二醇、乙二醇等。
非渗透性低温保护剂是指不能渗透到细胞膜内部。常见的非渗透性低温保护剂有海藻糖、葡聚糖等。此外近年来，也经常使用抗冻蛋白作为新型的低温保护剂。

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