ATAC-seq

寻找开放染色质区域的传统方法

寻找开放染色质区域的传统方法主要是MNase-seq和DNase-seq。这两个实验的思路是相似的：在染色质开放时，DNA和组蛋白的浓聚程度会降低，有一部分DNA暴露出来。而一旦失去了蛋白质的保护，这部分DNA就可以被DNA酶（MNase或DNase）所切割。然后，我们再把切割完的DNA拿来测序，和已知的全基因组序列相比较，就能发现被切掉的是哪些东西？没有被切掉的地方又在哪里？就知道开放的染色质区域在哪里了。不过，这两个方法有明显的缺陷。即耗时费力、重复性差。因此产生了一种全新的方法即ATAC-seq。

ATAC-seq

ATAC-seq：是美国Stanford大学的William Greenleaf教授在2013年所研发的一种全新方法，利用DNA转座酶结合高通量测序技术，来研究染色体的可进入性。DNA的复制，基因的转录，需要将DNA的高级结构解开，这部分打开的染色质，称为开放染色质（open chromatin），而打开的染色质，就允许一些调控蛋白（比如转录因子和辅因子）与之结合。染色质的这种特性，叫做染色质的可及性（chromatin accessibility）。DNA转座酶实现转座要求插入位点的染色质是开放的，因此Tn5转座酶也可以结合在染色质开放区域，并可对基因组进行切割，切割下来的序列形成转座酶复合物上，因此使用携带barcode 的Tn5转座酶复合物进行切割，之后在通过PCR扩增构建测序文库，并对测序文库进行测序，可以获得Tn5结合区域的相关信息，这样就知道哪些区域是开放染色质了。与开放染色质结合大多是一些调控蛋白，因此，ATAC-seq中的peak，往往是启动子、增强子序列，以及一些反式调控因子结合的位点。

ATAC-seq应用

1）表观遗传修饰是否在研究者感兴趣的课题中起到一定作用（主要是通过比较疾病组和正常组的ATAC-seq的差异，从而推测表观遗传是否在疾病中起到一定作用）
“我感兴趣的生物学问题跟表观遗传调控有关系吗？我担心直接做ChIP-seq、DNA甲基化等表观实验看不到差异。”这时，不妨先做ATAC-seq，看开放染色质是否有变化，做一个对表观遗传学调控是否参与了我感兴趣的生物学问题的基本判断。
2）通过ATAC-seq定义的open chromatin区域，再结合motif分析，识别哪种转录因子参与了基因表达调控（对于抗体质量不好的TF，尤其有效）
3）ATAC-seq与RNA-seq 联合分析，分析染色质开放状态与基因表达水平的关系，寻找关键调控元件通过对 ATAC+RNA-seq 的数据进行分析,可以获得如下结果:

1. 获得在特定时空下基因组中所有处于开放状态的序列,分析调控元件;
2. 分析染色质开放区域 motif,获得潜在与其结合的转录因子等调控蛋白;
3. 样本间差异开放区比较,结合转录组差异表达数据,寻找关键调控蛋白。

ATAC-seq能回答的问题：

1. 找调控某一生物学过程的关键转录因子；
2. 找哪个转录因子调控了我感兴趣的基因；
3. 找我感兴趣的转录因子调控的靶基因。

转录因子 Motif 分析

在试验中鉴定的 Peak 区域，为染色质开放的区域，含有转录因子结合位点（transcription factor binding site, TFBS），此位点对于转录因子介导的基因表达的调控起到重要的作用。因此，我们可以通过鉴定富集在 Peak 区域的代表性的 Motif（over- represented）序列推测结合在此区域的潜在的转录因子。使用所有样本的 motif 与数据库已知转录因子的 motif 进行富集。

ATAC-Seq与CHIP-Seq的异同

ATAC-Seq所需细胞量少，实验简单，可以在全基因组范围内检测染色质的开放状态，目前已经成为研究染色质开放性的首选技术方法。
ChIP-seq: 经典研究转录因子与DNA结合的方法，利用超声波打断染色质，但是通量较低。需要使用特异性的蛋白抗体来富集其结合的DNA，一次反应只能提供一个转录因子的DNA结合信息。而且制备时间较长，需要3-4天。ChIP-Seq是揭示特定转录因子或蛋白复合物的结合区域，实际是研究DNA和蛋白质的相互作用，利用抗体将蛋白质和DNA一起富集，并对富集到的DNA进行测序。

ATAC-Seq与ChIP-Seq的不同的是ATAC-Seq是全基因组范围内检测染色质的开放程度，可以得到全基因组范围内的蛋白质可能结合的位点信息，一般用于不知道特定的转录因子，用此方法与其他方法结合筛查感兴趣的特定调控因子；但是ChIP-Seq是明确知道感兴趣的转录因子是什么，根据感兴趣的转录因子设计抗体去做ChIP实验拉DNA，验证感兴趣的转录因子是否与DNA存在相互作用。ATAC-Seq、ChIP-Seq、Dnase-Seq、MNase-Seq、FAIRE-Seq整体的分析思路一致，找到富集区域，对富集区域进行功能分析。

文章参考：
ATAC-seq 技术简介

ATAC-seq技术简介