听觉刺激期间的神经血管耦合：ERPs和fNIRS血流动力学

导读

强度依赖性振幅变化(IDAP)已在事件相关电位(ERPs)中进行了广泛的研究，并与多种精神疾病相关联。本研究旨在探讨功能近红外光谱(fNIRS)在IDAP范式中的应用，该范式与ERPs相关，可以指示神经血管耦合的存在。两个实验分别有33和31名参与者。第一个实验包括持续500ms的三种音调强度(77.9dB、84.5dB和89.5dB)，每种类型随机呈现54次，而第二个实验包括连续呈现8个音调(每个音调持续70ms)的五种音调强度(70.9dB、77.9dB、84.5dB、89.5dB和94.5dB)，这些音调序列被呈现20次。使用EEG测量ERP成分：N1、P2和N1-P2峰峰振幅。fNIRS允许对听觉、视觉和前额叶皮层的血流动力学活动进行分析。结果显示，随着听觉强度的增加，N1、P2和N1-P2峰峰振幅均增加。同样，在听觉和前额叶皮层中，氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白浓度分别随听觉强度的增加而增加和下降。Spearman相关性分析显示，左侧听觉皮层与N1振幅、右侧背外侧皮层与P2振幅之间存在关联，特别是对脱氧血红蛋白浓度而言。这些发现表明，通过EEG和fNIRS可以获得大脑对听觉强度变化的反应，并支持神经血管耦合过程。总体而言，本研究增强了我们对fNIRS在听觉范式中的应用的理解，并强调了其作为ERP补充技术的潜力。

前言

近几十年来，为了深入理解人类大脑的复杂性，人们提出了整合不同生理参数的技术。其中一个例子就是将具有高时间分辨率的EEG与提供良好空间信息的功能磁共振成像(fMRI)或功能近红外光谱(fNIRS)相结合。这种新的研究范式有望获得更可靠、更全面的结果，在认知神经科学中非常有用。与fMRI相比，fNIRS在技术上更适用于共配准，考虑到由于容积传导而难以分析涉及ERPs生成的区域，fNIRS可以很好地在ERPs提供的动态信息中增加空间信息。此外，血流动力学响应取决于对血氧的间接测量，从而导致对刺激的反应延迟。因此，这两种技术可以一起使用，以更好地、互补地理解认知过程。然而，同时记录也有一些缺点。一方面，同时记录两种信号可能会给受试者增加压力。另一方面，在实验设计中，需要同时考虑EEG和fNIRS信号的测量准则。由于它们具有不同的响应时间，因此应调整刺激之间的间隔与刺激或任务的性质以找到预期的响应。

脑电和血流动力学反应技术的结合可以用“神经血管耦合”的过程来解释。该过程涉及脑电活动以及响应刺激或一系列刺激呈现的脑血流量的增加。正常的大脑活动由大脑动脉持续自我调节。当血压降低时放松，当血压增高时收缩，从而维持稳定的颅内压。当存在刺激或诱导认知状态时，与脑电活动相结合，脑血管激活会发生偏离基线的变化。正常活动的变化被视为是脑血流量的增加，并被称为“功能性充血”。神经血管耦合是指神经电活动和功能性充血耦合的机制。神经血管反应是基于神经元活动需要大量能量(葡萄糖)和氧气来产生ATP并维持神经传递和神经通讯机制的假设。目前被广泛接受的假设是活动诱导的神经元变化介导神经血管耦合。突触活动会释放神经递质和K+，启动和维持神经血管反应。

fNIRS是一种通过测量大脑激活所引起的血流动力学变化来评估大脑活动的方法。大脑活动与引起脑组织光学特性变化的各种生理过程有关。因此，fNIRS技术通过脑组织对近红外(NIR)光的“透明度”来测量大脑皮层的血流动力学变化。适当波长的近红外光可以被血液发色团吸收或散射在组织中。光的衰减主要是由大脑中的主要发色团——血红蛋白引起的。在大脑中，氧合血红蛋白(HbO)和脱氧血红蛋白(HbR)通常是主要的吸收体，这使得光学方法能够量化主要的血流动力学变量。

从生理学上讲，该技术基于以下假设：活跃的神经元通过神经血管耦合过程，使周围血管附近的动脉血流增加。这种增加补偿了由突触后激活和动作电位引起的葡萄糖和氧气消耗。因此，区域性脑血流(CBF)供过于求，导致HbO浓度增加和HbR浓度降低。这种现象被称为血流动力学反应函数(HRF)，其典型特征是神经电反应发生之间有2s的延迟。这些变化开始时急剧上升，在刺激开始后约6-10s达到稳定期。根据神经血管过程的假设，在神经激活后，血管肌肉松弛，导致血流增加以超额补偿能量消耗。这种超额补偿或功能性充血是正常大脑功能的基本现象。它被定义为大脑区域中的小动脉和毛细血管对局部高神经活动的反应性扩张。

fNIRS因其非侵入性和静默性而成为研究听觉刺激范式的最佳工具。相比之下，fMRI通常不适合此目的，因为仪器产生的恒定噪声会干扰刺激的呈现。尽管存在这种局限性，但大多数考察声音强度或频率与听觉皮层激活之间关系的研究都是用fMRI进行的。这些研究发现，随着刺激频率或强度的变化，听觉皮层的BOLD反应会增加。此外，其振幅也会随强度的增加而变化。这些效应常见于颞上回内侧和外侧区域，如耳蜗核、下丘、内侧膝状体等。

脑电图是一种通过放置在头皮上的电极记录脑电活动的方法。该记录捕获了与处理刺激的脑区中神经元同步电活动总和相关的电压变化。然而，由于容积传导，最终记录的信号反映了从附近区域传播的多个激活的总和，从而导致空间分辨率较差。事件相关电位(ERPs)定义为特定刺激或运动反应在特定时间窗和头皮位置上的电压变化，可通过对记录的试次信号进行平均来检测这种反应，从而提高信噪比(SNR)。听觉ERPs可以从EEG信号中提取，以评估脑电活动对声波振幅或其他参数变化的反应。最常研究的听觉ERPs包括P1(刺激开始后40-60ms出现的正向偏转)、N1(刺激开始后60-150ms出现的负向偏转)和P2(刺激开始后150-250ms出现的正向偏转)。一些研究已经确定了声级强度与N1和P2成分振幅之间的相关性，称为听觉诱发电位的响度依赖性(LDAEP)或强度依赖性振幅变化(IDAP)。研究表明，N1和P2成分中强度依赖性的调节可能归因于听觉皮层，特别是IV层，其表现出高浓度的5-羟色胺神经支配。因此，听觉诱发成分的强度依赖性已被提出作为中枢5-羟色胺能活动的指标。

最近的研究在听觉刺激范式中使用了fNIRS和EEG，并且在某些情况下发现了两种技术之间的相关性，表明存在神经血管耦合。例如，Ehlis等人(2009)发现感觉门控数量与双击期间左侧前额叶和颞叶皮层的血流动力学反应强度之间存在正相关。同样，语言研究也报告了EEG测量和相关脑区的激活或偏侧化之间的关系。然而，一些研究并未一致地发现这种明确的关系，这表明窃血现象可能会产生掩蔽效应，并进而影响fNIRS信号。目前，关于声强的研究主要使用fMRI来关联ERPs(N1，P2)和血流动力学活动。这些研究，以及已知的强度变化对N1、P2和N1-P2振幅的影响，发现了强度水平与初级听觉皮层中活跃体素数量之间存在相关性。然而，各研究的结果并不一致。Mulert等人(2005)发现BOLD信号幅度与声强水平之间没有关系，而Thaerig等人(2008)则发现在较高的声音强度下，体素数量和BOLD信号幅度均有所增加。这种反应不仅限于初级听觉皮层，而且在赫氏回、颞平面中也能观察到，并且存在右半球偏侧化。同样，Neuner等人(2014)发现随着强度增加，激活的区域范围更广，包括前扣带回、岛盖和眶额皮层等。激活随强度增加最为明显的是赫氏回和岛叶皮层。然而，尽管fNIRS和fMRI都测量血流动力学活动，但与fMRI相比，fNIRS存在空间局限性。此外，常用的连续波fNIRS设备测量的是浓度值的变化，而不是绝对值。因此，在解释研究结果时应考虑到这些局限性。据所知，Chen等人(2015)和Muñoz-Caracuel(2021)是目前唯一将EEG和fNIRS结合起来评估声音强度依赖性变化的研究。然而，他们的fNIRS结果与fMRI研究结果并不一致。

尽管许多研究都集中在分析听觉刺激上，但关于大脑如何处理声音、声音特性(包括强度)如何在神经上表征、神经血管耦合在这一过程中的作用，以及fNIRS技术对解决这些问题的潜在贡献等问题仍未解决。除了伴随刺激的血流动力学反应特征外，一个重要问题是它与潜在神经活动的相关程度，因此它是否与输入刺激的强度成比例变化。本研究旨在分析fNIRS是否可以成为检测听觉皮层声强变化的良好工具，这些变化在ERPs研究中与各种精神疾病有关。总的来说，本研究可以为神经血管耦合假说提供证据支持，而且对健康大脑中神经血管耦合的更好理解可以成为神经血管评估的工具，并产生新的临床应用。

方法

参与者

在第一个实验中，共有33名受试者(9名男性和24名女性，平均年龄=25.21±3.26岁)参与了研究；在第二个实验中，共有31名受试者(17名男性和14名女性，平均年龄=25.83±3.90岁)参加了研究。选择标准为：在两个实验中，所有参与者的听力正常，无神经或精神疾病史。在实验开始前，告知受试者实验程序和方案，并签署了知情同意书。这些研究遵循《赫尔辛基宣言》，并获得了安达卢西亚军政府伦理委员会的批准。

实验程序

听觉刺激是使用放置在计算机显示器两侧的两个Dell A215扬声器进行传递的，并使用E-Prime 2.0软件包呈现。在第一个实验中，呈现了三种不同强度(77.9、84.5和89.5dB)的声音刺激，持续时间为500ms，共54次。每个声音刺激后有一个持续时间为14±2s的沉默时间。刺激的呈现顺序对于每个受试者来说都是随机的。在第二个实验中，听觉刺激包含五种不同的音调强度(70.9、77.9、84.5、89.5、94.5dB)，以每个纯音持续时间为70ms的8个纯音为一组，且相邻刺激之间的间隔为0.430ms。刺激序列之后是14±2s的沉默，并呈现20次。两个实验中的声强都是使用放置在参与者耳朵位置的声级计(Velleman-DVM1326)进行测量和控制的。实验持续时间约为30-35min，在此期间，参与者被要求尽可能少动。为了增强对实验的忍耐力和坚持度，在播放这些声音刺激的同时让参与者观看一部无声电影。该电影只是用作分散注意力，参与者不需要做出反应。

信号采集和处理EEG记录

EEG使用Brain Vision V-Amp DC放大器(Brain Products，Munich，Germany)进行记录，使用活性电极(ActiCAP)记录第一个实验的7个头皮部位(F3、F4、Fz、FC1、FC2、FCz、Cz)，以及第二个实验的11个头皮部位(AFF1、AFF2、FFC1、FFC2、FCC1、FCC2、CZ、CPP1、CPP2、PPO1、PPO2)。用四个电极记录眼动：两个电极放置在每只眼睛外眦以记录水平眼动，另外两个放置在右眼上方和下方以记录垂直眼动。使用BrainVision Recorder 1.20(Brain Products)进行数据采集，DC放大增益设置为20000，记录期间不进行数字滤波。采样率为1000Hz。

功能性近红外光谱(fNIRS)

fNIRS信号使用NIRScoutXP设备(NIRx Medical Technologies，Glen Head，NY，USA)进行记录。在第一个实验中，使用了16个LED光源和16个探测器，基于10-20系统放置在头皮两侧的颞区和枕叶区域。为了提高fNIRS数据对皮层活动的特异性，在fNIRS设置中添加了16个短距通道(8mm)。在第二个实验中，使用了17个LED光源和38个探测器，它们位于头皮两侧的额区和颞区，从而获得了60个标准通道和16个短距通道。第一个实验的采样率为3.9063Hz，第二个实验为3.67Hz。

将原始fNIRS数据导入Homer2和Matlab R2019b(MathWorks Inc.，MA，USA)软件包中。使用enPruneChannels函数来消除噪声通道，去除极端值(0.03-2.5)或具有高标准差(信噪比=5和变异系数=17)的通道。应用hmrMotionCorrectionWavelet函数减少信号中的运动伪影，四分位距(IQR)为1.5。为了进一步去除伪影，本研究应用了hmrMotionArtifact函数(SDThresh=15；AMPThresh=0.7；tmotion=0.5；tmask=1.0)，时间窗为-2到10s(enStimRejection)。采用带通滤波器(hpf=0.010，lpf=0.50)减少信号中的生理干扰。然而，考虑到该滤波器不适用于提取与血流动力学响应频率重叠的生理信号，本研究进行了PCA分析(enPCAFilter；nSV=1)。通过频谱功率分析来验证需要提取的成分数量。最后，根据修正的Beer-Lambert定律计算血红蛋白浓度，760nm和850nm波长的差分路径长度因子分别为6和5。在第一个实验中，滤波和处理后的信号在-2到13s的时间窗内取平均值，对于第二个实验，在-5到16s的时间窗内取平均值。

统计分析

为了考察不同声强水平下的反应，本研究对两种信号(EEG和fNIRS)进行了双因素PERMANOVA分析。PERMANOVA在PAST软件中执行了10000次置换。这种分析方法使用的是置换检验，其优点是不需要满足正态性假设，因此更适用于fNIRS血红蛋白动力学信号的非正态分布。

在EEG信号中，为了选择要分析的成分，对所有被试、电极和刺激类型进行了平均，如图2A所示。这种方法能够以无偏的方式选择成分分析的时间窗。因此，选择的成分为N1(100-170ms)和P2(第一个实验为190-240ms，第二个实验为190-260ms)，并对N1-P2的峰峰幅值进行了分析。对于fNIRS统计分析，使用fNIRS Optodes的Location Decider软件(fOLD) 选择感兴趣区域(ROIs)。实验一选取听觉皮层(Brodmann 41-42)和颞上回(Brodmann 22)特异性最高的通道，构成听觉ROI。选取初级视皮层(Brodmann 17)作为视觉ROI。在第二个实验中，除听觉皮层外，还包括背外侧前额叶皮层(Brodmann 46)和前额叶皮层(Brodmann 9)区域。

与选择ERPs的过程类似，采用平均ROI和强度来确定刺激后活动的无偏时间窗。对于第一个实验，考虑到活动的峰值发生在5.5s，因而选择了3.5-7.5s的时间窗。第二个实验在6s左右观察到活动峰值，因此选择4-8s的时间窗。在进行统计分析之前，使用isoutlier函数排除含极端值(伪迹超过25%)的被试。因此，fNIRS统计分析的第一个实验为31名被试，第二个实验为29名被试。

在第一个实验中，将每个区域选择的通道合并为左听觉皮层、右听觉皮层和视觉皮层(ROI=3)。在第二个实验中，考虑了左听觉皮层、右听觉皮层、左背外侧前额叶皮层、右背外侧前额叶皮层和前额叶皮层(ROI=5)。分析了各种类型血红蛋白(HbO、HbR和HbT)的ROIs和强度。然后对显著性因素进行了事后分析，并使用错误发现率(FDR)进行校正。第一个实验以视觉通道作为对照。将每一种血红蛋白类型的ROI与HbO和HbR的基线进行比较。此外，为了评估神经血管耦合，在每个ROI中，对具有最高活性电极的P2和N1振幅(以降低数据维数)与HbO、HbR和HbT的fNIRS强度进行了Spearman相关性分析(经FDR校正)。

结果

ERPs图1B显示了与强度相关的ERPs响应，以及两个实验中用于分析的时间窗。在第一个实验中，N1成分的PERMANOVA结果显示了显著的强度主效应(p=0.005)。电极主效应和交互作用(强度电极)不显著(所有p＞0.05)。经FDR校正后显示，强度1(77.9dB)与强度2(84.5dB)和3(89.5dB)之间存在显著差异(p=0.006)。对于P2成分，PERMANOVA显示强度的主效应显著(p＜0.001)，电极的主效应和交互作用(强度电极)不显著(所有p＞0.05)。经FDR校正后显示，强度3(89.5dB)与强度1(77.9dB)和2(84.5dB)之间存在显著差异(p＜0.001)。N1-P2峰-峰振幅的PERMANOVA结果显示强度的主效应显著(p＜0.001)，电极的主效应和交互作用(强度*电极)不显著(所有p＞0.05)。经FDR校正后显示，强度1(77.9dB)与强度2(84.5dB)和3(89.5dB)之间(p＜0.001)，以及强度2(84.5dB)与强度3(89.5dB)之间存在显著差异(p=0.001)。比较结果和数据分布如图2所示。

图1.A)电极均值和强度均值的听觉ERPs结果。B)Cz电极上的听觉ERPs结果。上方和下方分别为第一个实验和第二个实验的结果。灰色区域表示用于统计分析的时间窗。

图2.在实验一中，三种强度存在显著差异的小提琴箱线图。每个强度的均值用红线表示。*p≤0.05；**p≤0.001

对于具有五种强度的第二个实验，PERMANOVA分析显示，N1成分的强度主效应显著(p＜0.001)，电极主效应和交互作用(强度电极)不显著(所有p＞0.05)。事后FDR校正分析显示，强度1(70.9dB)与强度3(84.5dB)、4(89.5dB)和5(94.5dB)之间存在显著差异，以及强度5与强度2(77.9dB)、3(84.5dB)和4(89.5dB)之间也有显著差异。对于P2成分，PERMANOVA 分析结果显示，电极和强度的主效应显著，两者之间的交互作用(强度电极)不显著。电极事后分析显示，Cz电极点与FCC1和FCC2电极点之间存在显著差异。对于强度，FDR校正结果显示，强度1与强度2、3、4和5之间存在显著差异，以及强度5与强度2和3之间也有显著差异。最后，对于N1-P2峰峰差异，PERMANOVA分析显示电极和强度的主效应显著，而交互作用(强度*电极)不显著。电极的事后分析结果与P2的结果类似，Cz电极点与FCC1和FCC2电极点之间存在显著差异。对于强度，FDR校正结果显示，强度1与强度2、3、4和5之间存在显著差异，以及强度5与强度2、3和4之间；强度2和3之间也存在显著差异。事后比较和数据分布如图3所示。

图3.在实验二中，五种强度的ERPs结果具有显著效应的小提琴箱线图。每个强度或电极的平均值用红线表示。*p≤0.05；**p≤0.001

血流动力学反应在第一个实验中，首先对每个感兴趣区域(ROI)与基线进行了t检验比较。对强度进行平均分析的结果显示(图4)，HbO和HbR发色团的左右听觉皮层与基线相比存在显著差异。t值显示了两个听觉皮层血流动力学典型反应的期望值，即HbO为正和HbR为负。同时，视觉ROI的血流动力学反应相较于基线的差异不显著。

图4.每个ROI中HbO和HbR的浓度变化。R AC(右听觉皮层)、L AC(左听觉皮层)、VSC(视觉皮层)。

图5显示了不同ROI中HbO和HbR在三种听觉刺激下测得的fNIRS血流动力学反应。HbO浓度的PERMANOVA分析显示，ROI(p=0.007)和强度(p=0.006)的主效应显著，而两者的交互作用(强度ROI)不显著(p＞0.05)。ROI的FDR校正结果显示，视觉皮层与左右听觉皮层之间存在显著差异(p=0.023)。强度的FDR校正结果显示，强度2(77.9 dB)与强度3(84.5 dB)之间存在显著差异(p=0.012)。在HbR浓度方面，PERMANOVA显示ROI具有显著主效应(p＜0.001)，而强度的主效应和交互作用(强度ROI)不显著(所有p＞0.05)。进一步分析显示，视觉皮层与左右听觉皮层之间存在显著差异。HbT浓度的PERMANOVA分析显示，强度的主效应显著(p=0.006)，而ROI的主效应和交互作用(强度*ROI)不显著(所有p＞0.05)。事后分析显示，强度2(77.9dB)和3(84.5dB)之间存在显著差异(p=0.007)。这些结果及其分布情况如图6所示。

图5.在实验一中，HbO和HbR在不同刺激强度下的浓度变化。R AC(右听觉皮层)，L AC(左听觉皮层)，VSC(视觉皮层)。

图6.实验一中，fNIRS统计结果存在显著效应的小提琴箱线图。*p≤0.05；**p≤0.001

与实验一类似，在实验二中，将各个ROI的强度均值与基线进行t检验比较(经FDR校正，图7)。结果显示，左听觉皮层、右听觉皮层、左背外侧皮层和前额叶皮层的HbO发色团存在显著差异。对于HbR，所有ROI与基线相比均显示出显著差异。同样，与第一个实验类似，HbO的t值为正，HbR的t值为负。如图7所示，右背外侧皮层的HbO浓度差异不显著可能是由于背外侧皮层的响应存在延迟。

图7.在实验一的每个ROI中，HbO和HbR浓度随强度的平均变化情况。

图8显示了五个ROI中HbO和HbR发色团对五种听觉刺激强度(70.9dB、77.9dB、84.5dB、89.5dB和94.5dB)的血流动力学反应。HbO浓度的PERMANOVA分析显示，ROI(p＜0.001)和强度(p=0.003)的主效应显著，而交互作用(强度ROI)不显著(p＞0.05)。ROI的FDR校正显示，右侧听觉皮层与左侧听觉皮层、右背外侧皮层、左背外侧皮层和前额叶皮层之间存在显著差异。强度的事后分析显示，强度5(94.5dB)与强度1(70.9dB)、2(77.9dB)和3(84.5dB)之间存在显著差异。HbR浓度的PERMANOVA分析显示，ROI(p＜0.001)和强度(p＜0.001)的主效应显著，而交互作用(强度ROI)不显著(p＞0.05)。ROI的FDR校正显示，右侧听觉皮层与右背外侧皮层、左背外侧皮层和前额叶皮层之间存在显著差异，以及左侧听觉皮层与前额叶皮层之间也存在显著差异。强度的事后分析显示，强度5与强度1、2、3和4之间存在显著差异。显著效应和数据分布如图9所示。

图8.在实验二的每个ROI中，HbO和HbR的浓度随刺激强度的变化情况。

图9.实验二中，五种强度的fNIRS统计结果存在显著效应的小提琴箱线图。*p≤0.05；**p≤0.001

在第一个实验的Spearman相关性分析中，由于PERMANOVA分析显示不存在电极效应，因此对EEG中央电极的N1和P2平均波幅与以ROI为单位的HbO、HbR和HbT进行相关性分析，结果未显示出显著相关性。在第二个实验中，对Cz电极点的N1和P2振幅与以ROI为单位的HbO、HbR和HbT之间进行了Spearman相关性分析(经FDR校正)。与FCC1和FCC2电极点相比，Cz电极点的振幅更大，因此选择Cz电极进行相关性分析。然而，结果显示HbO与HbT并没有显著的相关性，仅HbR发色团与左侧听觉皮层的N1振幅和右背侧皮层的P2振幅之间存在显著相关性(经FDR校正)，图10显示了Spearman相关矩阵和线性回归，正如预期的那样，N1与HbR呈正相关(p=0.002)，而P2与HbR呈负相关(p=0.031)。

图10.A)在第二个实验中，HbR和Cz电极点的N1和P2振幅的Spearman相关性(经FDR校正)。B)N1、P2与fNIRS HbR浓度呈显著相关。

结论

本研究为EEG和fNIRS检测到的大脑中存在强度依赖性反应提供了证据，支持在听觉范式中存在神经血管耦合的观点。这些结果表明，同时记录脑电和近红外信号可以充分利用EEG的良好时间分辨率和fNIRS的空间分辨率，因为神经血管耦合表明这两种信号在功能上是相关的。总体而言，这项研究有助于我们理解电信号和血流动力学信号如何在听觉范式中相互作用，并强调了在未来研究中整合EEG和fNIRS的潜在益处。

参考文献：Muñoz, V., Muñoz-Caracuel, M., Angulo-Ruiz, B.Y. et al. Neurovascular coupling during auditory stimulation: event-related potentials and fNIRS hemodynamic. Brain Struct Funct (2023). https://doi.org/10.1007/s00429-023-02698-9

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