三角褐脂藻基因组重复序列注释方法

三角褐脂藻的基因组则是经典株CCAP 1055最常用的版本 ASM15095v2，而基因组注释则来自Ensembl Protists，然而目前为止，基因组仍然没有官方的重复序列注释，所以我们自己来进行重头注释。

三角褐脂藻重复序列分析，采用RepeatModeler + RepeatMasker 的方法进行。两个软件通过bioconda，可方便地安装最新版：

conda install -c bioconda RepeatModeler=2.0.1 RepeatMasker=4.1.1

分析方法解析

首先获取基因组序列：

wget ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/protists/release-48/fasta/phaeodactylum_tricornutum/dna/Phaeodactylum_tricornutum.ASM15095v2.dna_sm.toplevel.fa.gz
gunzip Phaeodactylum_tricornutum.ASM15095v2.dna_sm.toplevel.fa.gz

Ensembl的参考序列，有dna，dna_sm，dna_rm的区分。若为模式物种，dna_sm命名的序列中，重复区域的碱基会以小写字母表示，而dna_rm序列中的重复区域，碱基统一被N取代。然而，三角褐脂藻基因组中并未有被mask的重复序列。

然后，开始分析重复序列，依次输入下面的命令运行RepeatModeler：

Genome=Phaeodactylum_tricornutum.ASM15095v2.dna_sm.nonchromosomal.fa
cpu=48
# RepeatModeler 版本 2.0.1
mkdir ./RM_Ref
BuildDatabase $Genome -name ./RM_Ref/ptr
RepeatModeler -database ./RM_Ref/ptr -pa $cpu $Genome

这段命令需要在48线程的机器上面，运行一小时左右。最终，产生了一个文件夹：./RM_1032.ThuNov120837532020/。而文件夹当中最重要的一个文件，就是consensi.fa.classified，为三角褐脂藻基因组专门产生的一个重复序列模式文件，下面调用RepeatMasker做重复序列分析也要用到它：

## RepeatMasker版本: 4.1.1
RepeatMasker -pa $cpu -e ncbi \
  -lib  ./RM_1032.ThuNov120837532020/consensi.fa.classified \
  -dir ./RepeatMasker -no_is $Genome

其中-e ncbi设置序列比对方法，我们选用的比对Engine是rmblast。在RepeatMasker的说明文档中，对该参数进行了详细描述：

-e(ngine) [crossmatch|wublast|abblast|ncbi|rmblast|hmmer]
        Use an alternate search engine to the default. 
        Note: 'ncbi' and 'rmblast' are both aliases for the rmblastn search engine engine. The generic NCBI blastn program is not sensitive enough for use with RepeatMasker at this time.

blast工具家族中有专门针对重复序列进行比对的rmblast，而普通的blastn比对重复序列不够敏感。

RepeatMasker只运行10分钟左右，即得到了结果。

重复序列结果解读

在结果文件夹./RepeatMasker中，产生了重复序列的结果文件。几个比较重要的文件如下：

• $Genome.tbl: 重复元件的Summary。该文件记录了各类主要重复元件的区间大小和比例信息。
• $Genome.mask: 重复序列被hard masked(即重复序列的碱基全部被N代替)的基因组。
• $Genome.out: RepeatMasker产生的重复序列结果的详细记录。在RepeatMasker官网上，主要模式物种的重复序列也是以这个形式记录的。另外，我使用自编脚本，将这个文件转成了gff格式，方便后续分析。

$Genome.tbl中内容如下：

==================================================
file name: Phaeodactylum_tricornutum.ASM15095v2.dna_sm.toplevel.fa
sequences:            89
total length:   27568093 bp  (27135064 bp excl N/X-runs)
GC level:         48.76 %
bases masked:    2248897 bp ( 8.16 %)
==================================================
               number of      length   percentage
               elements*    occupied  of sequence
--------------------------------------------------
Retroelements         1023      1236666 bp    4.49 %
   SINEs:                0            0 bp    0.00 %
   Penelope              0            0 bp    0.00 %
   LINEs:                0            0 bp    0.00 %
    CRE/SLACS            0            0 bp    0.00 %
     L2/CR1/Rex          0            0 bp    0.00 %
     R1/LOA/Jockey       0            0 bp    0.00 %
     R2/R4/NeSL          0            0 bp    0.00 %
     RTE/Bov-B           0            0 bp    0.00 %
     L1/CIN4             0            0 bp    0.00 %
   LTR elements:      1023      1236666 bp    4.49 %
     BEL/Pao             0            0 bp    0.00 %
     Ty1/Copia        1023      1236666 bp    4.49 %
     Gypsy/DIRS1         0            0 bp    0.00 %
       Retroviral        0            0 bp    0.00 %

DNA transposons        206       156271 bp    0.57 %
   hobo-Activator       24         4610 bp    0.02 %
   Tc1-IS630-Pogo        0            0 bp    0.00 %
   En-Spm                0            0 bp    0.00 %
   MuDR-IS905            0            0 bp    0.00 %
   PiggyBac             79        84490 bp    0.31 %
   Tourist/Harbinger     0            0 bp    0.00 %
   Other (Mirage,        0            0 bp    0.00 %
    P-element, Transib)

Rolling-circles          0            0 bp    0.00 %

Unclassified:         2350       741230 bp    2.69 %

Total interspersed repeats:     2134167 bp    7.74 %


Small RNA:               0            0 bp    0.00 %

Satellites:              0            0 bp    0.00 %
Simple repeats:       2612       109600 bp    0.40 %
Low complexity:        117         5130 bp    0.02 %
==================================================

* most repeats fragmented by insertions or deletions
  have been counted as one element
                                                      

RepeatMasker version 4.1.1 , default mode

run with rmblastn version 2.9.0+
The query was compared to classified sequences in ".../consensi.fa.classified"

结果中几个关键点：其一，反转录转座子中只有LER/Copia，占全基因组比例为4.49%，其二，DNA转座子占比较低。这部分结论，与2009年的BMC Genomics文章吻合：这篇文章给的LTR占比为5.8%，但是RNA转座子也只有Copia。

接下来工作建议

1、以这部分工作为基础，建立统一的基因组重复序列注释标准，将来分析其他物种；

2、 这部分的结果与先前重复序列的结果进行比较和整合，评估可否升级先前的注释内容。