CRISPR-Cas9学习笔记

1. 背景

看到基因编辑技术这个题目,就想到这几个问题
是什么?有什么分类?各有何不同?有什么用?优缺点?选择的依据?
先看中文文章可以快速了解背景,而后根据实验设计需求,钻研好的英文protocol。

目前已有的基因编辑技术 (针对这点应该加以展开,不过这里我只对自己需要用的CRISPR-Cas9进行了解)

(1)Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas)9 第三代人
工核酸内切酶(前两代就是ZFN和TAILEN)。
(2)锌指核酸内切酶(zinc finger endonuclease,ZFN):是第一代人工核酸内切酶

锌指是一类能够结合DNA的蛋白质,人类细胞的转录因子中大约有一半含有锌指结构,ZFN 是将锌指蛋白与核酸内切酶 Fok I融合形成的核酸内切酶,利用它可
以在各种复杂基因组的特定位置制造 DNA 的双链
切口(这就是英文文献中说到的DSB,当时只当是DNA双链断裂,却不知其实叫做双链切口)。
(3)类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALEN):第二代
人工核酸酶。
(4)人工核酸内切酶(engineered endonuclease,
EEN)

以上三种基因编辑技术(1-3)均可用于各种复杂基因组的编辑。
But! 无论是 ZFN 还是 TALEN,这两种人工核酸酶都是由 DNA 结合蛋白与核酸内切酶Fok I融合而成,这就意味着,当需要对新的DNA靶点进行编辑的时候,就需要设计新的核酸内切酶序列(结合之前英文文献的说法,如有错误,请指正)。

2. CRISPR/Cas9是什么?

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR):是在细菌中发现的有规律成簇又带间隔的短回文序列,可以帮助细菌抵抗噬菌体的入侵,是细菌针对噬菌体的获得性免疫(厉害吧!细菌也不是吃素的)。
Cas:CRIPSR/Cas系统有Type I、II 、III三种类型。而Type II则有一个标志性的Cas9 蛋白(分子质量很大的多功能蛋白),主要参与 crRNA的成熟以及降解入侵的噬菌体 DNA 或是外源质粒。CRISPR/Cas系统(识别+结合功能)和Cas9蛋白(剪切,降解)结合成复合体。

CRISPR/Cas9系统
5' tracrRNA+Cas9+Cas1, Cas2, Csn2+引导序列+CRISPR

3. CRISPR/Cas9的作用机制

这部分参考自http://blog.sciencenet.cn/blog-3160644-983657.html
首先,这是CRISPR/Cas9系统

CRISPR-Cas9学习笔记_第1张图片
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组装系统
CRISPR-Cas9学习笔记_第2张图片
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工作
CRISPR-Cas9学习笔记_第3张图片
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应用
CRISPR-Cas9学习笔记_第4张图片
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1.1.3 CRISPR/Cas9的优缺点

优点:高效,方便,快捷。CRISPR/Cas9 的定点突变效率至少是 TALEN 的 2倍以上,并且诱发双等位基因的效率更高
性缺点:有相当的脱靶概率

4. CRISPR/Cas9的用途

CRISPR/Cas9被改造成第三代人工核酸内切酶,用于复杂基因组的编辑,目前该技术应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠及细菌等五种的基因组精确修饰,例如各种基因工程小鼠。

5. 修饰类型(应简单学习一下)

  1. 基因定点 InDel 突变
  2. 基因定点敲入
  3. 两位点同时突变和小片段的缺失

参考文献:

  1. 方锐, 畅飞, 孙照霖, 等. CRISPR/Cas9 介导的基因组定点编辑技术[J]. 生物化学与生物物理进展, 2013, 40(8): 691-702.
  2. 程成, 舒鹏程, 彭小忠. CRISPR/Cas9 基因编辑系统研究进展[J]. 基础医学与临床, 2018, 38(4): 543-547.

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