Nanopore测序笔记

原理：基于不同建立经过纳米孔时，电流信号的差异
典型应用：

• 读长比较长，利于拼接
• 解决动植物多倍体高重复、高杂合的特性
• 也适用于细菌拼接
• 对RNA直接测序，无需反转录，直接识别RNA的碱基修饰
• 适合检测大片段结构变异
• 测序长度越长对定相分析越有利

测序设备

设备名称	特点
minION	入门选择，手持式，数据量30Gb
GridION	相当于5张芯片外加一台服务器
PromethION	24或48个测序芯片，数据量达到Tb级别
MinION Mk1C	可连接蓝牙或者Sim卡
Flongle	MinION和GridION的转换器
MinIT	预装Linux系统
VolTRAX	自动化文库制备

建库测序
对待测DNA的一些处理，是一个模板过程。

• DNA提取
  评估核酸质量和完整性
  可以使用Nanodrop仪器进行检验。
  DNA ：A260/A280 = ~1.8 ，A260/A230=~2.0-2.2
  RNA : A260/A280 = ~2.0 ，A260/A230=~2.0-2.2
  评估片段大小
  使用Agilent Bioanalyzer/Tapestation，PFGE，fragment analyzer，FEMTO pulse
  nanopore建库
  
  

  建库图
  
  给待测DNA两侧先加上A碱基，使平末端变成粘性末端，然后再加上Y接头以及马达蛋白。
  测序错误
  碱基识别的非准确性，每秒读数也不恒定。信号读取的频率无法做到一个碱基读一个，而是多个碱基一起读一个信号，相当于一个分类器。

nanopore测序文件可以生成fast5文件和fastq文件
fast5文件: 大而全，耗存储大，适合做碱基校正和表观遗传学分析。记录着设备运行时全部的信息，包括捕获的电信号值，设备运行时间，电压，温度等等信息。

• 可以使用HDFView 查看Fast5文件格式。https://www.hdfgroup.org/downloads/hdfview/
• 可以使用ont_fast5_api软件对fast5文件进行拆分与合并

fastq文件：常用，厂商一般给的，包含碱基和碱基质量
流程
Basecalling：将原始测序文件转换为碱基序列的过程
，如guppy工具主要包括三大功能：
1、碱基识别
这是它的主要功能，Guppy使用神经网络算法（RNN)将电信号数据解读为DNA或RNA的五个标准碱基，即腺嘌呤，鸟嘌呤，胞咳淀，胸腺咳淀和尿密淀。
2、拆分条码数据
如果建库时添加了barcode条形码，那么在序列开端和尾端均有Oxford Nanopore Technologies提供的条形码序列，Guppy数据拆分功能基于识别出的碱基序列。这个原理类似于illumina basecalling中的index拆分。
3、比对
将测序数据与参考序列进行比对，其实这个是调用minimap2做的，而且选项参数都是内置的，无法调整，所以，这个功能还是不要使用了，一个软件还是把自己该做的事情做好。
4、甲基化修饰位点检测
如果某个碱基发生了甲基化修饰，那么在碱基识别过程中就会表现出一些异常信息，这些离群信息有可能就是潜在的甲基化修饰位点，guppy目前也可以进行碱基修饰的检测，不过这个需要学习集，不同物种需要单独的学习集，目前只试验了大肠杆菌，人等模式生物，如果有需要可以尝试进行检测。
下载和安装参考官网

使用minion_qc来进行统计绘图

常用软件

软件名	功能	官方网址
bioconda	生物软件商店	http://bioconda.github.io/
sratoolkit	SRA数据管理	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/docs/toolkitsoft
flappie	碱基识别	https://github.com/nanoporetech/flappie
albacore	碱基识别	https://github.com/Albacore/albacore
guppy	碱基识别	nanopore社区
MINKNOW	测序操控软件	nanopore社区
hdfview	查看fast5	https://www.hdfgroup.org/downloads/hdfview/
ont_fast5_api	拆分合并fast5	https://github.com/nanoporetech/ont_fast5_api
pomoxis	综合分析	https://github.com/nanoporetech/pomoxis
minion_qc	质控绘图	https://github.com/roblanf/minion_qc
Filtlong	过滤	https://github.com/rrwick/Filtlong
seqkit	序列处理工具包	https://bioinf.shenwei.me/seqkit/
nanopack	数据质控顾虑包	https://github.com/wdecoster/nanopack
NanoPlot	质控绘图	https://github.com/wdecoster/NanoPlot
Porechop	过滤	https://github.com/rrwick/Porechop
MaSuRCA	拼接	https://github.com/alekseyzimin/masurca
Tulip	拼接	https://github.com/Generade-nl/TULIP
spades	拼接	https://github.com/ablab/spades
canu	拼接	https://github.com/marbl/canu
NextDenovo	拼接	https://github.com/Nextomics/NextDenovo
RaGOO	参考引导	https://github.com/malonge/RaGOO
Unicycler	拼接	https://github.com/rrwick/Unicycler
MECAT	拼接	https://github.com/xiaochuanle/MECAT
NECAT	拼接	https://github.com/xiaochuanle/NECAT
miniasm	拼接	https://github.com/lh3/miniasm
WTDBG2	拼接	https://github.com/ruanjue/wtdbg2
SMARTdenovo	拼接	https://github.com/ruanjue/smartdenovo
RA	拼接	https://github.com/rvaser/ra
gfatools	gfa文件处理	https://github.com/lh3/gfatools
medaka	纠错	https://github.com/nanoporetech/medaka
pilon	纠错	https://github.com/broadinstitute/pilon/wiki
racon	纠错	https://github.com/lbcb-sci/racon
NextPolish	纠错	https://github.com/Nextomics/NextPolish
quast	拼接评估	http://bioinf.spbau.ru/quast
busco	拼接评估	https://gitlab.com/ezlab/busco
bwa	短序列比对	https://github.com/lh3/bwa
samtools	sam格式处理	https://github.com/lh3/samtools
minimap2	比对	https://github.com/lh3/minimap2
NGMLR	比对	https://github.com/philres/ngmlr
last	比对	http://last.cbrc.jp/
GraphMap	比对	https://github.com/isovic/graphmap
MarginAlign	比对	https://github.com/benedictpaten/marginAlign
MUMMER	全局比对	http://mummer.sourceforge.net/
megan	物种鉴定	http://ab.inf.uni-tuebingen.de/software/megan6/download/
diamond	blast比对	https://github.com/bbuchfink/diamond
seqtk	序列处理工具	https://github.com/lh3/seqtk
taxonkit	物种分类鉴定	https://bioinf.shenwei.me/taxonkit/
Centrifuge	物种分类	https://github.com/DaehwanKimLab/centrifuge
Nanopolish	综合分析	https://github.com/nanoporetech/nanopolish
NanoSV	变异检测	https://github.com/mroosmalen/nanosv
Sniffles	变异检测	https://github.com/fritzsedlazeck/Sniffles
NanoVar	变异检测	https://github.com/benoukraflab/NanoVar
tombo	甲基化	https://github.com/nanoporetech/tombo
bcftools	vcf格式处理	https://github.com/samtools/bcftools
Truvari	变异检测	https://github.com/spiralgenetics/truvari/
Pinfish	异构体鉴别	https://github.com/nanoporetech/pinfish
pychopper	异构体鉴别	https://github.com/nanoporetech/pychopper
tablet	可视化	https://ics.hutton.ac.uk/tablet/
IGV	可视化	http://software.broadinstitute.org/software/igv/

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原作者 公众号 基因学苑